genklonering: genomisch materiaal & banken

Question 1

genklonering

Answer 1

chromosomaal (genomisch) DNA & kopie mRNA

Question 2

gene library vs cbank

Answer 2

g: prok + gist
c: euk

Question 3

genomsiche bank

Answer 3

collectie recombinante vectors die samen hele genoom van bron org voorstellen

Question 4

cDNA

Answer 4

geen introns (insertiecap verhoogt)
seq die genexpressie regelen, niet vervat in mRNA
transcriptie afhankelijk (promotor actief)
geen promoter
vergelijken expressie bij omstandigheden (selectieve exp)

Question 5

gDNA

Answer 5

lage abundantie (1 gen/cel)
intronen
promoter & flankerende regio’s

Question 6

probleem hele genoom verknippen in verschillende vectoren

Answer 6

digest variabele groottes, vooral ligatie kleinere
geen volledige representatie
na digest terugpuzzelen onmogelijk

Question 7

oplossing onvolledige representatie

Answer 7

partieel digest, -> overlappingen

Question 8

grote genomen

Answer 8

BAC & YAC
RE 6nt

Question 9

kleine genomen

Answer 9

lambda & cosmiden
RE 4nt, knippen vaker

Question 10

nu volledige representatie maar… + oplossing

Answer 10

RE niet gelijk verspreid -> fragmenten niet geschikt klonering
aanliggende seq RE kunnen knip bevorderen of verhinderen
sec structuur ook invloed
=> verschillende RE

Question 11

andere methoden dan RE + nadeel

Answer 11

• mechanische shearing via naald/sonificatie
  N: hoe kleiner hoe minder vatbaar -> blunt/onregelmatige einden
• andere enzymen: micrococcal nuclease tss histonen
  N: blunt ends

Question 12

factoren invloed vectorkeuze

Answer 12

grootte insert
grootte library voor voldoende representatie genoom
(hoe groter insert hoe kleiner library)
grootte genoom

Question 14

opslag DNA fragmenten DNA banken

Answer 14

pooling getransformeerde kolonies (plaques)
-> vloeibaar medium, diepvries
-> repooling: heruitplaten, amplificatie

Question 15

isolatie RNA

Answer 15

olige(dT) gecoate kolom/beads

Question 16

cDNA synthese 1e streng

Answer 16

1) poly-a-staart -> olige(dT) molecule als primer
=> overwicht 3’ + kans 5’ mRNA niet haalt (sec. structuur)
1) random primers (overlappende fragmenten)

Question 17

methoden 2e streng

Answer 17

S1 nuclease
de land
de gubler & hoffman

Question 18

S1 nuclease tekening

Answer 18

p32

Question 19

S1 nuclease methode

Answer 19

Nadeel: veel seq 5’ gaan verloren

Question 20

de land methode

Answer 20

dC nucleotiden aan 3’ (TdT)
dC zone als template oligo dG molecule (primer)
alkalische degradatie -> verw. mRNA
probleem:
sterke cG -> sequenering issue
weinig controle # c’s

Question 21

de gubler & hoffman methode

Answer 21

oligo(dT)
RNase H -> nicks
DNA polymerase -> nick translatie (seq overschrijven)
DNA ligase
probleem:
klein stuk in begin niet overgeschreven (blijft RNA)

Question 22

de land tekening

Answer 22

p33

Question 23

de gubler & hoffman methode tekening

Answer 23

p33

Question 24

oplossingen sequenering issue:

Answer 24

haarspelden uitsmelten
random primers op mRNA
adapter -> in plasmide -> sequenering

Question 25

bacterieël cDNA

Answer 25

geen intronen
beperkte genoomgrootte
geen poly-A staart
-> genomische bank
bac mRNA = korte levensduur
polycistronisch

Question 26

wanneer wel cDNA bank voor bacterien

Answer 26

onderzoek wanneer welke genen tot expressie