splaats specifieke mutagenese Flashcards
oplossing codon bias
site-directed mutagenese (plaatspecifieke)
plaats specifieke mutagenese
= seq op spec plaats veranderen > codon toepasbaar in gastheer, finale EW blijft
= oligonucleotide-gedirigeerde mutagenese
> controle via sequenering
RE herkenningsplaats
verknipping (te muteren site) > exonuclease
> deletie / insertie (synthetische oligonucleotide)
> ssDNA verwijderd (S1 nuclease)
> ligatie
> AGEF (selectie gemut
> transformeren > unieke kolonies, unieke mutatie
primer-gebaseerde plaats specifieke mutagenese met 2 PCR rondes + tekening
mismatch annealing
> lineaire fragmenten
> 4 primers (2 mismatch AB, 2 match DC)
> PCR reactie AD & BC
p65
primer-gebaseerde plaats specifieke mutagenese met selectie methoden
> circulair DNA
PCR 2 primers (match & mismatch)
vormt lineair dsDNA + nicks > ligase
scheiden moeilijker (DpnI of dut-ung selectie)
transformatie kolonie > sequenering
Dpni endonuclease selectie
parentale plasmide in E.coli (dam+/dcm+) > methyleren
> 2 mismatch primers
- hemi-gemethyleerd DNA gevoelig afbraak Dpni endonucl.
- recombinant DNA niet gemethyleerd, intact
> transformatie E. coli, nick hersteld
selectie verwijdering RE + tekening
mutagene primer + selectieprimer (RE herk. verwijderen)
> beide op ssDNA zelfde richting & anealen zelfde ssDNA parentale
> DNA polymerase, dNTPs, ligase
» hybride
- pDNA isolatie (RE > parentaal verknipt)
- transformeren
p66
de kunkel in vivo selectiemethode + tekening
> template in dut-/ung- E.coli
- dut-mut inactiveert dUTPase > U ipv T
- ung-mut inactiveert U-N-glycosidase > U niet verwijdert
te muteren insert in fasmide > ss replicatie (f1/M13 ori)
plasmide met U isoleren, ss variant maken
- mismatch primer, klenow, dNTPs, ligase, ATP
> hybride
transformeren in E.coli (dut+/ung+)
- U -> A
p66-67