sequeneringstrategie Flashcards
primer walking tekening
> 1000 bp
p72
shotgun sequentiebepaling / contig assembly
contig = gecombineerd, telkens aan elkaar lassen
> tot 10 000 bp
> partieel digest > library > (semi) random kleiner fragmenten (overlappend)
> seq willekeurige kloons
gaps opvullen via walking
next generation sequencing toepassing
- controle klonering seq controle (nauwk. res mapping, PCR)
- onbekende ID
- ID coderen gebied reading frame, intronen
- expressiesignalen onderzoeken consensusgebied: prom,…
- DNA-sequentie vgl
methoden next gen sequencing
pyrosequencing
bridge amplificatie
SOLiD sequencing
voordelen nextgen sequencing
high throughput
kost/staal
kloneren niet nodig
tijd/staal
pyroscquencing
> partiele digest/sonificatie
ligatie adapters dsDNA fragmenten
denatureren
5’ beads binden
emulsie PCR op beads
- water-olie emulsie; amp 1 streng op bead in 1 druppel
1 bead / well
seq primers tegen adapters
seq verlengd
- elke dNTP ingebouwd > PPi vrij > enz reactie
(APS + PPi + ATP-sulfurylase -> ATP)
(ATP + luciferine luciferase -> licht)
inactieveren door apyrase
SOLiD sequencing + tekening
> emulsie PCR & binding beads
primer aan adapter
probes met =/= signaal
- eerste 2nt probe matchen, andere 3 niet
gaps 3 nt
3x steeds deletie in adapter
na 5 rondes volledige seq
p74-75
toepassing SOLiD
- resequencing: seq genoom om vgl referentie
> vgl scaffolding (bestaand seq)
> polymorphisms & mutaties
bridge amplificatie sequencing tekening
p76
waarom sequenering
- basis info > verwerken, uploaden databanken
- annotatie = ID wat gesequeneerd, voorspelling, afwijkend product
- genetische verwantschappen tss individen/soorten
methoden genexpressie bestuderen
- FISH
- northern blot
- RT-qPCR
- cDNA micro-array
- transcriptomics
metagenomics
data meerdere genomen
transcriptomics
RNA seq tot op single cell niveau
