3.7 proteomics, metabolomics, microRNA, siRNA Flashcards
wat is proteomics?
onderzoekt alle eiwitten van de cel
hoeveelheid eiwit is betere maat voor genexpressie dan mRNA omdat mRNA zorgt voor meer dan alleen eiwit synthese
hoe werkt massa spectrometrie?
manier om eiwit te identificeren
eiwit of eiwitmengsel–> trypsine digestie–> analyse met massa spectrometrie–> data vergelijking–> identificatie eiwit
wat doet trypsine?
darmenzym trypsine knipt peptidebindingen van eiwitten op specifieke plaatsen: op arginine (R) en lysine (K)
waarvoor wordt massa spectrometrie gebruikt?
massa spectrometrie kan:
- eiwit identificeren
- eiwit kwantificeren
- bindende eiwitten identificeren
- eiwitmodificaties identificeren (fosforylering, acetylering, methylering)
hoe gaat de massa spectrometrie bij eiwit interacties?
maak een lysaat van de cellen en isoleer het eiwit of eiwit-DNA complex waarin je geinteresseerd bent
elueer (uitwassen ) alle eiwitten die interactie hebben met dit eiwit
analyseer welke peptiden aanwezig zijn
wat is het voordeel van alle interacties bij massa spectrometrie in 1 fuguur zetten?
door alle interacties in 1 figuur te zetten (zoals bij massa spectrometrie) kan je meer te weten komen over de complexe regulatiecircuits in cellen
dit kan weer gebruikt wordne om genexpressie profielen te begrijpen
hoe kan je met massa spectrometrie eiwit modificaties identificeren?
eiwit mengsel–> trypsine digestie–> verrijk voor fosfopeptiden–> identificeer mbv massa spectrometrie
wat doen metabolomics?
analyseert welke metabolieten voorkomen bijvoorbeeld in het bloed
metaboloom= totale set metabolieten (bv suikers, nucleotiden, aminozuren )
in welke 5 stappen kan een metaboloom in kaart worden gebracht?
- sample preparation: eventueel zuiveringsstap
- massa spectrometrie
- identificatie mbv computer
- herkennen van patroon
- wat is de biomarker?
waarom in mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?
omdat het niet alleen voor de eiwit activiteit zorgt maar ook voor de regulatie van:
- eiwitmodificaties
- eiwitstabiliteit
- translatie
hoe gaat de regulatie van translatie?
regulatie van miRNA transcriptie
Drosha knipt het tot pre-miRNA
transport naar cytoplasma
dices knipt het tot miRNA
1 streng wordt ingebouwd in RISC complex
miRNA zorgt voor specificiteit, eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of mRNA afbraak
wat is het belang van microRNA op kanker?
miRNA beinvloedt de expressie van kanker gerelateerde genen bijv MiR16
MiR16 komt verlaagd tot expressie in aantal tumoren. het reguleert BCL2
minder MiR16 zorgt voor meer BCL2 waardoor de apoptose wordt geremd
ook zorgt minder MiR16 voor meer Cdc25A waardoor er progressie is van de celcyclus
hoe kan je de expressie van MiRNAs bepalen?
met microarrays en NGS kan je de expressie van honderden miRs tegelijkertijd bepalen
miR’s kunnen net als bij mRNAs expressieprofielen, geanalyseerd worden
goede diagnostische en prognostische waarde
combi met mRNA microarrays/ sequencing, proteomics en metabolomics geeft veel info
hoe worden korte RNAs gebruikt in onderzoek?
dsRNA in cel
dicer protein complex knipt het in kleine stukjes RNA (siRNAs)
siRNAs worden ingebouwd in het risc protein complex
RISC complex gaat dsRNA in stukken knippen
korte RNA’s worden gaan in RISC complex en RISC complex kan nu mRNA afbreken waartegen het korte RNA gericht is
dus door specifieke siRNA in cel te brengen kunnen specifieke stukken mRNA afgebroken worden
hoe kunnen we ingrijpen in de groei van kankercellen?
via DNA
mRNA
en eiwit
hoe kunnen we ingrijpen in de groei van kankercellen via eiwit?
CML philadelphia chromosoom:
het remmen van de kinase activiteit van BCR-Abl met imantibin
wat is een nadeel van het ingrijpen in de groei van kankercellen met imantinib/ een eiwit ?
specificiteit van dergelijke remmers is vaak een probleem
er kan gemakkelijk resistentie ontstaan
het zal vaak niet lukken om een geschikte remmer te vinden
hoe kunnen we ingrijpen in de groei van kankercellen via mRNA?
geen mRNA= geen eiwit
siRNAs zorgen voor mRNA afbraak (RNA interferentie, RNAi)
RNAi kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen
wat zijn voordelen van RNAi?
eenvoudig toe te passen op elk willeukeurig gen waar je de sequentie van weet
specifiek
door het mRNA op verschillende plekken met siRNAs aan te pakken, zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan
geschikt voor hoge doorvoer analyses
wat zijn nadelen van RNAi?
kan alleen gebruikt worden om expressie te remmen
weten nog niet hoe we siRNA in gewenste cellen moeten brengen
hoe gaan de RNAi screens om de achilleshiel van kankercellen te vinden?
siRNA voor veel genen elk in een aparte celkweek
in elke celkweek is nu 1 gen uitgeschakeld
analyseer het effect van de behandeling
kijk welke siRNAs celdood geven voor kankercellen maar niet voor normale cellen
controleer dan of er al remmers voor deze targets aanwezog zijn
controleer of die remmer inderdaad werkt in cellen en diermodellen
