3.7 proteomics, metabolomics, microRNA, siRNA

Question 1

wat is proteomics?

Answer 1

onderzoekt alle eiwitten van de cel

hoeveelheid eiwit is betere maat voor genexpressie dan mRNA omdat mRNA zorgt voor meer dan alleen eiwit synthese

Question 2

hoe werkt massa spectrometrie?

Answer 2

manier om eiwit te identificeren

eiwit of eiwitmengsel–> trypsine digestie–> analyse met massa spectrometrie–> data vergelijking–> identificatie eiwit

Question 3

wat doet trypsine?

Answer 3

darmenzym trypsine knipt peptidebindingen van eiwitten op specifieke plaatsen: op arginine (R) en lysine (K)

Question 4

waarvoor wordt massa spectrometrie gebruikt?

Answer 4

massa spectrometrie kan:
- eiwit identificeren
- eiwit kwantificeren
- bindende eiwitten identificeren
- eiwitmodificaties identificeren (fosforylering, acetylering, methylering)

Question 5

hoe gaat de massa spectrometrie bij eiwit interacties?

Answer 5

maak een lysaat van de cellen en isoleer het eiwit of eiwit-DNA complex waarin je geinteresseerd bent

elueer (uitwassen ) alle eiwitten die interactie hebben met dit eiwit

analyseer welke peptiden aanwezig zijn

Question 6

wat is het voordeel van alle interacties bij massa spectrometrie in 1 fuguur zetten?

Answer 6

door alle interacties in 1 figuur te zetten (zoals bij massa spectrometrie) kan je meer te weten komen over de complexe regulatiecircuits in cellen

dit kan weer gebruikt wordne om genexpressie profielen te begrijpen

Question 7

hoe kan je met massa spectrometrie eiwit modificaties identificeren?

Answer 7

eiwit mengsel–> trypsine digestie–> verrijk voor fosfopeptiden–> identificeer mbv massa spectrometrie

Question 8

wat doen metabolomics?

Answer 8

analyseert welke metabolieten voorkomen bijvoorbeeld in het bloed

metaboloom= totale set metabolieten (bv suikers, nucleotiden, aminozuren )

Question 9

in welke 5 stappen kan een metaboloom in kaart worden gebracht?

Answer 9

1. sample preparation: eventueel zuiveringsstap
2. massa spectrometrie
3. identificatie mbv computer
4. herkennen van patroon
5. wat is de biomarker?

Question 10

waarom in mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?

Answer 10

omdat het niet alleen voor de eiwit activiteit zorgt maar ook voor de regulatie van:
- eiwitmodificaties
- eiwitstabiliteit
- translatie

Question 11

hoe gaat de regulatie van translatie?

Answer 11

regulatie van miRNA transcriptie

Drosha knipt het tot pre-miRNA

transport naar cytoplasma

dices knipt het tot miRNA

1 streng wordt ingebouwd in RISC complex

miRNA zorgt voor specificiteit, eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of mRNA afbraak

Question 12

wat is het belang van microRNA op kanker?

Answer 12

miRNA beinvloedt de expressie van kanker gerelateerde genen bijv MiR16

MiR16 komt verlaagd tot expressie in aantal tumoren. het reguleert BCL2
minder MiR16 zorgt voor meer BCL2 waardoor de apoptose wordt geremd

ook zorgt minder MiR16 voor meer Cdc25A waardoor er progressie is van de celcyclus

Question 13

hoe kan je de expressie van MiRNAs bepalen?

Answer 13

met microarrays en NGS kan je de expressie van honderden miRs tegelijkertijd bepalen

miR’s kunnen net als bij mRNAs expressieprofielen, geanalyseerd worden

goede diagnostische en prognostische waarde

combi met mRNA microarrays/ sequencing, proteomics en metabolomics geeft veel info

Question 14

hoe worden korte RNAs gebruikt in onderzoek?

Answer 14

dsRNA in cel

dicer protein complex knipt het in kleine stukjes RNA (siRNAs)

siRNAs worden ingebouwd in het risc protein complex

RISC complex gaat dsRNA in stukken knippen

korte RNA’s worden gaan in RISC complex en RISC complex kan nu mRNA afbreken waartegen het korte RNA gericht is

dus door specifieke siRNA in cel te brengen kunnen specifieke stukken mRNA afgebroken worden

Question 15

hoe kunnen we ingrijpen in de groei van kankercellen?

Answer 15

via DNA
mRNA
en eiwit

Question 16

hoe kunnen we ingrijpen in de groei van kankercellen via eiwit?

Answer 16

CML philadelphia chromosoom:
het remmen van de kinase activiteit van BCR-Abl met imantibin

Question 17

wat is een nadeel van het ingrijpen in de groei van kankercellen met imantinib/ een eiwit ?

Answer 17

specificiteit van dergelijke remmers is vaak een probleem

er kan gemakkelijk resistentie ontstaan

het zal vaak niet lukken om een geschikte remmer te vinden

Question 18

hoe kunnen we ingrijpen in de groei van kankercellen via mRNA?

Answer 18

geen mRNA= geen eiwit

siRNAs zorgen voor mRNA afbraak (RNA interferentie, RNAi)

RNAi kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen

Question 19

wat zijn voordelen van RNAi?

Answer 19

eenvoudig toe te passen op elk willeukeurig gen waar je de sequentie van weet

specifiek

door het mRNA op verschillende plekken met siRNAs aan te pakken, zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan

geschikt voor hoge doorvoer analyses

Question 20

wat zijn nadelen van RNAi?

Answer 20

kan alleen gebruikt worden om expressie te remmen

weten nog niet hoe we siRNA in gewenste cellen moeten brengen

Question 21

hoe gaan de RNAi screens om de achilleshiel van kankercellen te vinden?

Answer 21

siRNA voor veel genen elk in een aparte celkweek

in elke celkweek is nu 1 gen uitgeschakeld

analyseer het effect van de behandeling

kijk welke siRNAs celdood geven voor kankercellen maar niet voor normale cellen

controleer dan of er al remmers voor deze targets aanwezog zijn

controleer of die remmer inderdaad werkt in cellen en diermodellen