3.3 chromosomale afwijkingen bij leukemie Flashcards
hoezo is cytogenetica relevant?
voor de diagnose
voor prognose
zegt wat over de reactie op chemotherapie
zegt wat over de leukemogenesis en hematopoese, het helpt met het identificeren van betrokken genen
hoe kan je chromosomale afwijkingem detecteren en identificeren?
klassieke cytogenetica (banderingstechnieken)
moleculaire cytogenetica
- fluorescente in situ hybridisatie (FISH)
- Array (SNP array)
moleculaire diagnostiek
- RQ-PCR (fusie genen)
- Q-PCR
- Sequencing (sanger–> NGS)
wat is de eerste stap van cytogenetisch onderzoek?
kweken
je gebruikt bloed (met blasten) of beenmerg
je voegt hier groeifactoren aan toe. dit duurt 1-2 dagen.
met colcemid (mitose blok) wordt de deling stopgezet en wordt er een hypotone oplossing toegevoegd waardoor de cellen kapot gaan.
de cellen worden gefixeerd met methanol-azijnzuur waardoor de membraan ontvet wordt. bij het druppelen van de suspensie op het glaasje zullen de membranen breken
laatste fase is bandering (G-/R-/Q-bandering). er is hierna een streepjescode op het dna te zien
wat zijn numerieke chromosomale afwijkingen?
winst (van een compleet chromosoom)
verlies (van een compleet chromosoom)
wat zijn gebalanceerde structurele chromosomale afwijkingen?
translocatie (uitwisseling van terminaal chromosomaal segment)
inversie (binnen een chromosoom)
insertie
wat zijn niet gebalanceerde structurele chromosomale afwijkingen?
deletie
amplificatie
niet gebalanceerde translocatie
gen mutatie
waaruit bestaat een chromosoom?
centromeer met erboven een korte arm P en eronder de lange arm Q
wat is terminale deletie?
deletie aan het uiteinden van een chromosoom
wat is interstitiele deletie?
deletie in het midden van een chromosoom
wat is translocatie?
er zijn 2 stukken chromosomaal materiaal uitgewisseld
wat is inversie?
waarbij een stuk chromosoom 180 °C is gedraaid
paracentrisch: aan een p of q arm
pericentrisch: aan een centromeer
hoe beschrijf je een karyogram?
gebruik vooreeld:
45,XY,-7[10]
t(9;11)(p22,q23)
chromosomenaantal, geslacht, bijzonderheden
er is uit op te maken dat het chromosoom 7 in 10 metafasen mist bij mannelijk karyotypen en dat hij 1 chromosoom mist (45 ipv 46)
breekpunten kunnen aangegeven worden dus:
translocatie op chromosoom 9 en 11. bij chromosoom 9 op de p arm op plek 22
chromosoom 11 op de q arm plek 23
wat zijn slechte risico afwijkingen bij AML?
complex karyotype–> slechte prognose
monosomaal karyotype (verlies van 2 autosomen dus verlies van twee monosomieen of er is sprake van 1 monosomie en een structurele afwijking)–> zeer slecht risico
andere onbekende afwijkingen
wat is FISH?
fluorescence in situ hybridization
het is een methode om mutaties zichtbaar te maken
het is gericht op een specifieke target
wat is probe selectie?
met probe wordt aangetoond of het stukje dna aanwezig is bij de patient
welke 2 methoden zijn er bij fish?
de metafase fish
de interfase fish
wat is de metafase fish?
fish op gekweekte (delende) cellen
- lymfocyten, leukocyten (beenmerg/bloed), solide tumoren
wat is interfase fish?
fish op kernen van niet/slecht delende cellen
- snelle analyse
- beoordeling op basis van aantal signalen (eventueel fusie-signaal, of break-apart probes)
wat zijn voordelen van fish?
detectie van microdeleties
breekpunt detectie en verbetering
detectie van cryptische translocaties en complexe genoom veranderingen
snelle diagnostische detectie op kenen in de interfase
demonstratie van kleine hoeveelheid van afwijkende cellen
wat zijn nadelen van fish?
gelimiteerde sensitiviteit
geeft alleen antwoorden op de gestelde vragen
beperkte target locaties om te onderzoeken
wat zijn fusie probes?
is om translocatie aan te tonen
als er geen translocatie is zie je 2x groen en 2x rood
als er wel translocatie is zie je een x geel (het fusie signaal), een x rood en een x groen
kan ook vals positief zijn als bijv het rode signaal boven de groene ligt door de 3D structuur van DNA. ziet er dan onterecht uit als een geel signaal
wat zijn break-apart probes?
stukken gaan uit elkaar als er een breuk tussenkomt
geen translocaties: 2 fusies dus 2x geel
wel translocatie: 1x geel (1 fusie), groen, rood
hoezo vormt MM een probleem bij cytogenetisch onderzoek?
multipel myeloom: moeizaam chromosomen onderzoek
afwijkende cellen delen niet of nauwelijks onder lab condities
hierdoor zie je vaak een normaal karyotype met afwijkende FISH op interfase kernen
het aantal afwijkingen zijn chromosoomaal niet zichtbaar (cryptisch)
wat is een oplossing voor het MM probleem?
hoger percentrage plasmacellen–> zuivering van de plasmacellen
hoe gaat de zuivering van de plasmacellen?
rode bloedcellen verwijderen met rode bloedcel lysis
zuivering met anti-CD138 kit (stem cell technologies)
wat is SNP array?
single nucleotide polymorphism
een genoom kan nu breed bekeken worden en worden fouten met kleine resoluties ook in kaart gebracht
hoe wordt SNP UITGEVOERD?
met 850.000 probes
er wordt getest of iemand voor een bepaalde SNP homozygoot of heterozygoot is
deleties en duplicaties kunnen makkelijk worden opgespoord
door de allelen kleurtjes te geven kan er worden gekeken naar de verhoudingen
hoe wordt SNP geanalyseerd?
mbv logR en B-allele frequency
logR is een maat voor de aantal kopieen die aanwezig zijn
B-allele frequency zegt iets over de frequentie van SNP
wat is analyse van SNP?
NORMAAL:
logR=2, allele frequency= AA, AB, BB
DELETIE
logR=1
allele frequency= A-, B-
DUPLICATIE
logR=3
allele frequency= AAA, BBB, AAB, ABB
VERLIES VAN HETEROXYGOSITEIT (LOH)
logR= 2
allele frequency= AA, BB
wat is verschil FISH en SNP?
FISH kan niet LOH opsporen en SNP array wel
SNP kan geen translocaties opsporen en FISH wel
