Vf metodos de transferencia de material genético Flashcards
transferencia de material genetico en bacterias
-conjugacion
-transducción
-transformación
año conjugacion por lederberg y tatum
1946
*al sembrar juntas dos cepas auxótrofas K12 de E. coli se aislaban colonias protótrofas
es el proceso de transferencia horizontal de material genético entre una célula bacteriana donadora y una receptora mediante el CONTACTO DIRECTO o una conexión q los una
conjugación
*-plasmidos. DNA extracromosómico
proceso mediante el cual el ADN es transferido de una bacteria a otra mediante un bacteriófago (particula fágica transductora, pseudovirion)
transducción
transduccion*
transferencia de cualquier región del genoma humano
generalizada
transduccion*
transferencia de loci adyacente al sitio de integración del profago
especializada
transduccion*
inicialmente un bacteriofago infecta a una bacteria y puede integrarse en el genoma bcteriano (profago) manteniendo el:
ciclo lisogenico antes de activar el ciclo litico (vegetativo)
transduccion*
tambien se utiliza para designar el proceso mediante el cual ADN exógeno es introducido en:
una célula mediante un vector viral
transduccion*
el ADN puede integrarse al genoma de la bacteria por:
recombinación sitio específica (homología de secuencia)
*de esta forma permanece en la bacteria de forma estable la nueva info genetica
transformante
celula q ha sido transformada
es variable en cada especie capaz de experimentar transformación
competencia
principio de transformacion
de Griffith 1928
*una bacteria muerta se degrada y libera fragmentos de adn al entorno. otra bacteria puede captar ese adn
codificada en el genoma o lograda de forma artificial
competencia
variación hereditaria de una celula bacteriana susceptible, originada por la captación de DNA desnudo libre en el medio, con la posterior integración del DNA exógeno en el genoma celular
transformación
ESTADO FISIOLOGICO CARACTERISTICO LIMITADO EN EL TIEMPO QUE PERMITE CAPTAR ADN DEL MEDIO EXTERIOR, influido por factores ambientales como la densidad celular del cultivo, temperatura, ph, nutrientes
competencia
en algunas especies de bacterias, q cuentan con la maquinaria especifica para llevar el ADN a traves de la membrana.
transformación natural
*codificada en los genes celulares
no esta codificada en los genes celulares, sino que es inducida por procedimientos en donde las celulas son convertidas en <permeables> (competentes) a traves de condiciones q normalmente no ocurren en la naturaleza</permeables>
transformación artificial
transformacion artificial*
muchas bacterias (celulas en general) carecen de :
sistemas naturales de transformacion
*se ha conseguido inducir el estado de competencia en celulas q no lo presentan de forma natural -ej e coli
ejemplos transformacion artificial
-quimica
-microinyeccion
-lipofeccion
-electroporacion
-vectores virales
-biobalística
quimica*
las celulas se incuban en hielo con el DNA exogeno en presencia de cationes divalente como:
Ca+2 (CaCl2) lo cual prepara las membranas celulares para ser permeables al DNA exogeno
transformacion artificial*
estas tecnicas se basan en tratamientos químicos o fisicos q producen microporos en la celula, lo q permite la introducción del:
DNA exogeno de modo bastante eficiente
quimica*
en seguida las celulas son incubadas a
42°C por 30 segundos (shock térmico) lo que causa q el adn entre en la celula
bajo el microsopio empleando microagujas y micromanipuladores
microinyeccion
el DNA se encapsula en liposomas (vasiculas esfericas compuestas de una doble capa de fosfolipidos), las cuales se fusionan enseguida con la membrana celular
lipofeccion
aumento de la permeabilidad de la membrana celular mediante aplicación de una campo electrico (10-20kV/cm)
electroporacion
*una exposicion excesiva a campos electricos puede causar la muerte celular
se aprovecha la capacidad naturl que tienen los virus de ingresar su info genetica a la celula blanco
vectores virales
se forman poros a traves de los cuales puede entrar el DNA exógeno
electroporación
se selecciona un virus adecuado con base a su estructura y se fabrican (pseudovirus) conteniendo la info genetica de interes
vectores virales
*pueden obstaculizar la replicación de un virus
pequeñas particulas de oro o tungsteno cubiertas de ADN se disparan a las celulas
biobalistica
*algo de material genetico se quedara en las celulas, transformandolas
la eficiencia de transformacion es baja, pero la mayoria de las plantas pueden ser transformadas con este medio
biobalistica
el termino de ________ describe una variedad de procesos q pueden usarse para producir copias geneticamente indenticas de un ente biologico
clonacion
clonación de DNA
-in vitro <acelular> (PCR)
-in vivo <celular></celular></acelular>
amplificacion de moleculas de acido nucleico mediante su introduccion, asistida por vectores, en celulas en cultivo
clonacion de proteinas
-sistemas de traduccion in vitro
-in vivo <celular></celular>
produccion de proteinas mediante la introduccion asistida por vectores, celulas en cultivo, de la info genetica requeria para la sintesis de dicha proteina
la clonacion celular se requiere el empleo de
vectores
es un portador, una molecula de DNA cuya mision es unirse con el fragmento de DNA llamado INSERTO para facilitar su entrada a la celula anfitriona
vector
*son elementos geneticos con capacidad autoreplicante
el inserto puede ser:
ADN genomico, cADN, producto de retrotranscripcion de arn, un producto de pcr, etc
aspectos importantes a considerar al seleccionar un vector
-tamaño max del inserto q admiten
-tipo de celula anfitriona en la q pueden incorporar el DNA recombinante
-plasmidos, muy empleados en la produccion de compuestos terapeuticos. virus, muy empleados para celulas eucariotas
clasificacion vectores*
capacidad de expresar el DNA recombinante
su objetivo es producir un transcrito (RNA) o a la proteina producto de ese transcrito
vector de expresion
clasificacion vectores*
su finalidad es almacenar secuencias y permitir la obtencion de grandes cantidades de inserto
vector de clonacion
caracteristica vector clonacion*
secuencias q le permiten mantener su:
replicación y la del adn q transportan, independientemente del adn genomico
-origen de replicacion y secuencias reguladoras en su caso
caracteristica vector clonacion*
secuencias codificadoras para un gen de seleccion. el producto del gen no debe estar presente en el tejido u organismo. para metodos geneticos o..
de seleccion fenotipica
-genes de resistencia (ampicilina, etc)
-genes reporteros (LacZ (B-galactosidasa), GFP (proteina verde fluorescente), luciferasa, etc)
-genes q complemetan defectos nutricionales en cepas mutantes (e coli TRP1, para crecer en un medio carente de Trp)
caracteristica vector clonacion*
sitios multiples de
clonacion
permite la seleccion de sistios de restriccion para la clonacion
vector de expresión*
presenta akgunas caracteristicas adicionales a las del vector de clonación:
-secuencias reguladoras
-promotor. fuerte/debil. inducible/no inducible
-operador
-sitio de unión a ribosoma (SUR) secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) secuencia Kozak (eucariotas)
-secuencia de termino de transcripción (TT). estabiliza RNAm
-secuencia de poliadenilación (eucariota)
-codon de inicio y codon de paro de la traduccion
region potenciadora/ promotora de CMV, q permite una fuerte expresion constitutiva en muchos tipos de celulas
Vector pCMVTnT
sitio multiple de clonacion
vector pCMVTnT
Sitio de poliadenilación de SV40 (virus vacoulado del simio)
Vector pCMVTnT
Procedimiento general vectores
- preparacion inserto
2.preparacion vector - preparacion de la construccion o constructo final (vector cargado con el inserto)
- transformación
- seleccion de transformantes
- propagación de trasformantes
- purificación de vectores o proteinas recombinantes. (respecto a los vectores, principalmente se refiere a los de clonación aunque en algun caso tmbn es de interes la clonacion de los vectores de expresion)
- preparacion del inserto
el DNA se acorta con la o las enzimas de restricción adecuadas
- preparación del vector
el policonector o sitio múltiple de clonacion (MCS) permite emplear cualquier combinación de enzimas de restricción
- preparación de la construcción
union covalente in vitro del inserto de DNA al vector cortado, empleando una ligasa
*la especificidad depende del tipo de extremos
4to paso de vectores¿*
transformacion
- seleccion de transformantes
una vez q la celula bacteriana ha sido transformada, esta crece en medios de cultivo selectivos solidos
metodos geneticos o de seleccion fenotipica
levantamiento de colonias o placas (colony or plaque lifts):
-hibridación, con sondas. deteccion de acidos nucleicos
-inmunohistoquímicos. con anticuerpos. deteccion de proteinas
- propagación de transformantes
se selceccionan las colonias de interes y se crecen en medios liquidos
la división de las celulas producira, junto con la replicacion de su genoma, la formación de copias del:
rDNA q se haya incorporado y por lo tanto se lleva a cabo la CLONACIÓN
Los vectores de expresion originarán la produccion del:
transcrito/proteina de interes en la célula bacteriana transformada (transfectada-eucariota)
