Vb enzimas de restricción, ligasas y polimerasas Flashcards
enzima q cortan o degradan los ácidos nucleicos hidrolizando el enlace fosfodiéster de nucleotidos continuos
nucleasas
exonucleasas actuan sobre los extremos -5´-3´
endonucleasas actuan sobre los enlaces nternos
enzimas que unen moleculas de DNA
ligasas
enzimas que sintetizan ácidos nucleicos
polimerasas
ezma rstr*
endodeoxiribonucleasas
tienen la capacidad de cortar DNA doble cadena en una SECUENCIA ESPECÍFICA
endonucleasas de restricción
ezm rstrn*
Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans ganaron el premio nobel en
1978
*endonucleasas restriccion ¿
ezms rstrn*
en la actualidad se conocen miles de ellas con más de ______ diferentes sitios de reconocimiento
100
*endonucleasas de restricción¿
sistema de defensa bacteriano contra patógenos, protegiéndolos del ataque de DNA foráneo (ej bacteriofago)
sistema de restricción-modificacion
sistema restr-modif*
endonucleasa q corta DNA de doble cadena rompiendo uniones fosfodiester DENTRO O FUERA de la secuencia de reconocimiento
restricción
sistema restr-modif*
metilasa q modifica el DNA por metilación en una base determinada siempre DENTRO de la secuencia de reconocimiento
metilación
sistema r-m*
ambas enzimas reconocen la misma secuencia de bases
v o f
verdadero
sistema r-m*
la metilación en las dos hebras del DNA evita que:
la enzima de restricción pueda cortar la molécula de DNA
sistema r-m*
la metilación protege al DNA genómico y plasmídico bacteriano del:
ataque de sus propias enzimas
cuando ambas cadenas están metiladas:
no hay metilación ni restricción
cuando sólo una cadena está metilada:
(hemimetilada)
hay metilación y no restricción
cuando ninguna cadena está metilada:
no hay metilación, si restricción
el sistema R-M sirve como sistema inmune
v o f
verdadero
corte de manera escalonada en dos puntos diferentes. pueden ser unidos (ligado) nuevamente. si provienen de la digestión de dos secuencias dif (ya sea con la misma enzima o con enzimas con extremos compatibles), se generará una nueva secuencia final (DNA recombinante)
extremos COHESIVOS O PEGAJOSOS
corte en un sólo punto en ambas cadenas
extremos ABRUPTOS (ROMO)
son distintas enzimas de restricción que reconocen la misma secuencia, con distintas especificaciones
isoesquizómeros
enzimas de restricción que reconocen distintas secuencias, pero dejan los mismos extremos
enzimas con extremos compatibles
muestra una secuencia de bases todos los posibles sitios de corte para las enzimas de restricción conocidas
mapa de restricción
se emplean programas informaticos para obtenerlos
mapas de restricción
nos permite seleccionar la enzima adecuada para editar la secuencia original y al final obtener la secuencia deseada
mapa de restricción
los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción pueden verse alterados por:
variaciones en la secuencia de DNA
las variaciones de secuencia es inherente en:
regiones polimorficas (varian entre individuos y sirven como marcador genético) o pueden deberse a una mutación
RFLP
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
segmentos de DNA de doble cadena producidos por la acción de una endonucleasa de restricción sobre un DNA más largo
fragmentos de restricción
procedimiento para los RFLP
-extracción de DNA de dif individuos
-Amplificación por PCR de la secuencia polimorfica y/o potencialmente mutante
-digestión empleando varias enzimas de restricción por separados y/o dif juegos de enzimas
-separación e identificación del número de fragmentos y sus dif longitudes (tamaños) por electroforesis en gel agarosa
-interpretación
un sitio de restricción (marcador genético) puede estar geneticamente ligado a :
una mutación q lo produce
*RFLPs en rasgos fenotípicos recesivos
los fragmentos de restricción del hijo están presentes en los fragmentos de restricción de:
la madre y del padre
es una enzima que tiene como función corregir las discontinuidades en la hebra de ADN generadas en la replicación (cadena retrasada), reparación de errores en la replicación o bien daño al DNA
ligasa
su papel en la biología molecular es catalizar la unión de fragmentos distintos de DNA, tanto si posee extremos romos o cohesivos, obteniéndose el correspondiente DNA recombinante
ligasa
forma enlaces covalentes entre el extremo 5´-fostato de una cadena polinucleótida y el extremo 3´-OH de otra cadena polinucleotida
ligasa
la ligación de extremos cohesivos requiere:
complementariedad de secuencia
la ligación de extremos romos NO requiere de secuencias complementarias:
dos extremos romos cualquiera pueden ser unidos por la DNA ligasa
polimerasas
-dna polimerasa rna dependiente
-dna polimerasa dna dependiente
-rna polimerasa dna dependiente
-rna polimerasa rna dependiente
trimming back, ligación
rasurar y ligación
*despues de la disgention por enzm rstricción en corte de cohesión, la exonucleasa corta 3´,5´y esos extremos se ligan entre sí a otros fragmentos romos
requeridas para los ciclos repetidos de desnaturalización (calentamiento) y polimerización del DNA
DNA polimerasas termoestables
la eficiencia de ligación es mayor de extremos:
cohesivos
q la de extremos romos
provienen de organismos cuyas enzimas son resistentes a las altas temperaturas
DNA polimerasas termoestables
corte, filling in
corte y llenado
