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Vc PCR y sus variantes Flashcards

1
Q

premio nobel en Química 1993

A

Kary Mullis

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Q

puede amplificar selectivamente una secuencia deseada de ADN de copia única q se encuentre presente en una mezcla compleja de moléculas de ADN sin purificación previa de la secuencia de interés

A

PCR

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2
Q

PCR

A

reacción en cadena de la polimerasa

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3
Q

logran que sólo se amplifique una zona del AND en la PCR

A

primers o cebadores (oligonucleotidos)

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3
Q

sintetiza la hebra complementaria incorporando los deoxinucleotidos trifosfato (dNTPs) libres (A, T, G, C) del medio de reacción, inicialmente dirigida por los primers o cebadores

A

DNA polimerasa termoestable

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4
Q

ciclos controlados de temperaturas de

A

desnaturalización
alineamiento
elongación

*Sin actividad a 4°C

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5
Q

Mezcla de reacción

A

-DNA
-primers o cebadores (oligonucleotidos)
-Taq polimerasa
-dNTPs (A, T, C, G)

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6
Q

ciclo 1*
aumentos de temperatura para romper

A

puentes de hidrogeno

*desnaturalización

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7
Q

ciclo 1*
la temperatura de desnaturalización usualmente es de:

A

94 o 95 °C

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8
Q

ciclo 1*
temperaturas mayor o igual a 90°C evitan

A

renaturalización del DNA

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9
Q

ciclo 1*¿
oligonucleotidos específicos (20-23 nt) cuya secuencia es complementaria a los extremos del fragmento (zona del DNA) q se desea amplificar

A

primers o cebadores

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10
Q

ciclo 1*
al disminuir la temperatura los primers:

A

hibridan especificamente en los extremos de la secuencia blanco. un primer en cada hebra

*alineamiento

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11
Q

temperatura del alineamiento

A

52 °C

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12
Q

ciclo 1*
los primers dirigen a la

A

ADN polimerasa q sintetiza la hebra complementaria incorporando los nuleotidos libres (A, T, G, C) del medio de reacción

*elongación/extensión

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13
Q

temperatura extensión

A

72°C

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14
Q

al final del 1er ciclo se tienen:

A

2 moleculas de ADN de doble cadena parcial q contienen a secuencia blanco

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15
Q

al final del 2do ciclo se obtienen:

A

4 moleculas de DNA doble cadena parcial q contienen la secuencia blanco

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15
Q

solo el ADN que contiene la secuencia blanco es copiado ya que:

A

la polimerasa solo puede copiar moleculas q tienen el cebador unido

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16
Q

al final del 3er ciclo se han sintentizado

A

8 moleculas de DNA doble cadena q contienen la secuencia blanco

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17
Q

al final del 4to ciclo se han sintentizado

A

16 moleculas de ADN doble cadena q contienen la secuencia blanco

*8 de producto específico

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18
Q

al final del 5to ciclo se obtienen

A

32 moleculas de DNA doble cadena q contienen la secuencia blanco

*22 producto específico

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19
Q

cuántos productos especificos hay en 10 ciclos?

A

1004

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20
Q

cuantos productos especificos hay en 20 ciclos?

A

1,048,536

21
Q

despues de 30 ciclos hay más de

A

1x10^9 moleculas del producto especifico y solamente 60 moleculas parcialmente doble cadena más largas

*1,073,741,744 productos especificos

22
Q

maquina del PCR
tiene la capacidad de mantener cambios de temperatura cíclicos de forma precisa

A

termociclador

23
Q

fases PCR

A

-exponential
-linear
-plateau

24
Q

fase del PCR q detecta PCR en tiempo real

A

exponencial

25
Q

fase del PCR q detecta el PCR convencional

A

Plateau

26
Q

ocr punto final o convencional*
un mayor numero de copias del DNA molde dan una banda más intensa del amplificado
v o f

A

verdadero

*hasta cierto punto, ya q cantidades excesivas de DNA molde inhiben la reacción

27
Q

pcr punto final o convencional*

a mayor numero de ciclos, mayor…

A

cantidad del producto de PCR (amplificado)

*hasta cierto punto, ya q llega el momento en q los componentes de la reacción se agotan y la amplificación se detiene (fase plateau)

28
Q

el tamaño del amplificado (producto de PCR) especifico q se espera en la reacción NO se conoce exactamente
v o f

A

falso

si se conoce examctamente, ya q se conoce la secuencia exacta y número de pb q los primers/cebadores están flanqueando

29
Q

variantes de la PCR

A

-con adaptadores
-inversa
-mutagénesis dirigida
-RT-PCR
-tiempo real (PCR cuantitativa-q PCR)
-RT-qPCR
-Multiplex

30
Q

amplificar una región de ADN de secuencia desconocida

A

PCR con adaptadores

31
Q

se unen adaptadores a los fragmentos de restricción de extremos cohesivos
se añaden primers especificos para las secuencias de los adaptadores

A

PCR con adaptadores

32
Q

este término se refiere a una amplia variedad de tecnicas in vitro q modifican la secuencia silvestre

A

mutagénesis dirigida

33
Q

permite amplificar secuencias desconocidas con la condición de q se encuentran al lado de una secuencia conocida de ADN

A

PCR inversa

34
Q

ej, cuando no hay sitios de restricción localizados en el lugar deseado, se puede emplear un enfoque de PCR

A

mutagenesis dirigida

35
Q

se pueden cambiar de una a tres bases en un segmento de DNA determinado sintetizando primers de PCR q lleven estos cambios

A

mutagénesis dirigida

36
Q

se emplean dos enzimas polimerasas

A

RT-PCR

*DNA polimerasa RNA dependiente y
DNA polimerasa DNA dependiente

37
Q

RT-PCR*
realiza la sintesis de cDNA a partir de mRNA

A

DNA polimerasa RNA dependiente (retrotranscriptasa)

38
Q

RT-PCR*
los clones de cDNA contienen secuencias codificantes q son:

A

discontinuos (mayoría de genes eucariotas)

39
Q

tambien conocida como PCR cuantitativa (qPCR)

A

PCR tiempo real

40
Q

amplifica y simultáneamente cuantifica de forma absoluta el producto específico de la amplificación

A

PCR tiempo real

41
Q

a la mezcla de reacción se adiciona un fluoróforo q emite fluorescencia en función de la abundancia del producto de amplificación

A

PCR tiempo real

*la medición de la fluorescencia se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto q se le denomina PCR en tiempo real

42
Q

numero de ciclos requeridos para q la fluorescencia específica sobrepase la fluorescencia de fondo inespecífica

A

Ct (cycle threshold)

*inversamente proporcional a la cantidad de DNA blanco

43
Q

PCR tiempo real*
tipos de fluorescencia

A

-SYBR Green
-Sondas TaqMan

44
Q

SYBR green*
no es un agente intercalante sino q se asocia a la molecula de ADN interactuando con la

A

hendidura menor

45
Q

el complejo resultante de ADN-SYBR Green presenta el pico de absorción en:

A

498nm y el de emisión en 522nm (zona verde del espectro, de ahí su nombre)

46
Q

su principio se basa en la actividad 5´-3´exonucleasa de la polimerasa
se aumenta significativamente la especifidad de detección

A

sondas Taq Man

*la fluorescencia resultante de la acumulación del produce se mide durante la fase exponencial de la PCR

47
Q

RT-qPCR

A

La primera reacción de retrotranscripción se lleva a cabo de la misma manera por DNA polimerasa RNA dependiente obteniendose una cDNA a partir de mRNA
despues el cDNA se amplifica por PCR cuantitativa

48
Q

RT-qPCR*
los niveles de expresión de un gen en particular se normalizan con respecto al nivel de expresión de un gen….

A

constitutivo para poder hacer la comparación entre las muestras, tratamientos y/o condiciones de la célula

49
Q

se amplifica más de una secuencia en una misma reacción

A

PCR multiplex

50
Q

emplea dos o más pares de primers en un único tubo de reacción con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de DNA

A

PCR multiplex

51
Q

utilizada para diagnóstico de enfermedades causadas por dif agentes y variantes de un mismo virus

A

PCR multiplex

52
Q

usa un primer “sense” común y un primer “antisense” específicos

A

PCR multiplex

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