Vc PCR y sus variantes Flashcards
premio nobel en Química 1993
Kary Mullis
puede amplificar selectivamente una secuencia deseada de ADN de copia única q se encuentre presente en una mezcla compleja de moléculas de ADN sin purificación previa de la secuencia de interés
PCR
PCR
reacción en cadena de la polimerasa
logran que sólo se amplifique una zona del AND en la PCR
primers o cebadores (oligonucleotidos)
sintetiza la hebra complementaria incorporando los deoxinucleotidos trifosfato (dNTPs) libres (A, T, G, C) del medio de reacción, inicialmente dirigida por los primers o cebadores
DNA polimerasa termoestable
ciclos controlados de temperaturas de
desnaturalización
alineamiento
elongación
*Sin actividad a 4°C
Mezcla de reacción
-DNA
-primers o cebadores (oligonucleotidos)
-Taq polimerasa
-dNTPs (A, T, C, G)
ciclo 1*
aumentos de temperatura para romper
puentes de hidrogeno
*desnaturalización
ciclo 1*
la temperatura de desnaturalización usualmente es de:
94 o 95 °C
ciclo 1*
temperaturas mayor o igual a 90°C evitan
renaturalización del DNA
ciclo 1*¿
oligonucleotidos específicos (20-23 nt) cuya secuencia es complementaria a los extremos del fragmento (zona del DNA) q se desea amplificar
primers o cebadores
ciclo 1*
al disminuir la temperatura los primers:
hibridan especificamente en los extremos de la secuencia blanco. un primer en cada hebra
*alineamiento
temperatura del alineamiento
52 °C
ciclo 1*
los primers dirigen a la
ADN polimerasa q sintetiza la hebra complementaria incorporando los nuleotidos libres (A, T, G, C) del medio de reacción
*elongación/extensión
temperatura extensión
72°C
al final del 1er ciclo se tienen:
2 moleculas de ADN de doble cadena parcial q contienen a secuencia blanco
al final del 2do ciclo se obtienen:
4 moleculas de DNA doble cadena parcial q contienen la secuencia blanco
solo el ADN que contiene la secuencia blanco es copiado ya que:
la polimerasa solo puede copiar moleculas q tienen el cebador unido
al final del 3er ciclo se han sintentizado
8 moleculas de DNA doble cadena q contienen la secuencia blanco
al final del 4to ciclo se han sintentizado
16 moleculas de ADN doble cadena q contienen la secuencia blanco
*8 de producto específico
al final del 5to ciclo se obtienen
32 moleculas de DNA doble cadena q contienen la secuencia blanco
*22 producto específico
cuántos productos especificos hay en 10 ciclos?
1004
cuantos productos especificos hay en 20 ciclos?
1,048,536
despues de 30 ciclos hay más de
1x10^9 moleculas del producto especifico y solamente 60 moleculas parcialmente doble cadena más largas
*1,073,741,744 productos especificos
maquina del PCR
tiene la capacidad de mantener cambios de temperatura cíclicos de forma precisa
termociclador
fases PCR
-exponential
-linear
-plateau
fase del PCR q detecta PCR en tiempo real
exponencial
fase del PCR q detecta el PCR convencional
Plateau
ocr punto final o convencional*
un mayor numero de copias del DNA molde dan una banda más intensa del amplificado
v o f
verdadero
*hasta cierto punto, ya q cantidades excesivas de DNA molde inhiben la reacción
pcr punto final o convencional*
a mayor numero de ciclos, mayor…
cantidad del producto de PCR (amplificado)
*hasta cierto punto, ya q llega el momento en q los componentes de la reacción se agotan y la amplificación se detiene (fase plateau)
el tamaño del amplificado (producto de PCR) especifico q se espera en la reacción NO se conoce exactamente
v o f
falso
si se conoce examctamente, ya q se conoce la secuencia exacta y número de pb q los primers/cebadores están flanqueando
variantes de la PCR
-con adaptadores
-inversa
-mutagénesis dirigida
-RT-PCR
-tiempo real (PCR cuantitativa-q PCR)
-RT-qPCR
-Multiplex
amplificar una región de ADN de secuencia desconocida
PCR con adaptadores
se unen adaptadores a los fragmentos de restricción de extremos cohesivos
se añaden primers especificos para las secuencias de los adaptadores
PCR con adaptadores
este término se refiere a una amplia variedad de tecnicas in vitro q modifican la secuencia silvestre
mutagénesis dirigida
permite amplificar secuencias desconocidas con la condición de q se encuentran al lado de una secuencia conocida de ADN
PCR inversa
ej, cuando no hay sitios de restricción localizados en el lugar deseado, se puede emplear un enfoque de PCR
mutagenesis dirigida
se pueden cambiar de una a tres bases en un segmento de DNA determinado sintetizando primers de PCR q lleven estos cambios
mutagénesis dirigida
se emplean dos enzimas polimerasas
RT-PCR
*DNA polimerasa RNA dependiente y
DNA polimerasa DNA dependiente
RT-PCR*
realiza la sintesis de cDNA a partir de mRNA
DNA polimerasa RNA dependiente (retrotranscriptasa)
RT-PCR*
los clones de cDNA contienen secuencias codificantes q son:
discontinuos (mayoría de genes eucariotas)
tambien conocida como PCR cuantitativa (qPCR)
PCR tiempo real
amplifica y simultáneamente cuantifica de forma absoluta el producto específico de la amplificación
PCR tiempo real
a la mezcla de reacción se adiciona un fluoróforo q emite fluorescencia en función de la abundancia del producto de amplificación
PCR tiempo real
*la medición de la fluorescencia se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto q se le denomina PCR en tiempo real
numero de ciclos requeridos para q la fluorescencia específica sobrepase la fluorescencia de fondo inespecífica
Ct (cycle threshold)
*inversamente proporcional a la cantidad de DNA blanco
PCR tiempo real*
tipos de fluorescencia
-SYBR Green
-Sondas TaqMan
SYBR green*
no es un agente intercalante sino q se asocia a la molecula de ADN interactuando con la
hendidura menor
el complejo resultante de ADN-SYBR Green presenta el pico de absorción en:
498nm y el de emisión en 522nm (zona verde del espectro, de ahí su nombre)
su principio se basa en la actividad 5´-3´exonucleasa de la polimerasa
se aumenta significativamente la especifidad de detección
sondas Taq Man
*la fluorescencia resultante de la acumulación del produce se mide durante la fase exponencial de la PCR
RT-qPCR
La primera reacción de retrotranscripción se lleva a cabo de la misma manera por DNA polimerasa RNA dependiente obteniendose una cDNA a partir de mRNA
despues el cDNA se amplifica por PCR cuantitativa
RT-qPCR*
los niveles de expresión de un gen en particular se normalizan con respecto al nivel de expresión de un gen….
constitutivo para poder hacer la comparación entre las muestras, tratamientos y/o condiciones de la célula
se amplifica más de una secuencia en una misma reacción
PCR multiplex
emplea dos o más pares de primers en un único tubo de reacción con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de DNA
PCR multiplex
utilizada para diagnóstico de enfermedades causadas por dif agentes y variantes de un mismo virus
PCR multiplex
usa un primer “sense” común y un primer “antisense” específicos
PCR multiplex
