IVd secuenciación de proteínas y cristalografía Flashcards
flujo de trabajo
1 extracción de proteinas
2 separacion de las proteinas
3 procesamiento para secuenciación
flujo de trabajo
procesamiento para secuenciación
-agentes reductores
-alquilación de cisteínas
-hidrolisis completa permite determinar cuáles aa están presentes y en que proporcion
-disgestiones individuales con dos diferentes agentes para obtener péptidos menores a 3kDa, purificacion de los fragmentos, secuenciación de cada fragmento, determinación de la secuencia global por traslape de los fragmentos individuales
fragmentación de cadenas polipeptidicas
todos son proteasas excepto
bromuro de cianógeno
*es un químico
reacciones para identificar el aminoacido N-t
sanger
edman
secuenciacion de sanger
reactivo de sanger
2,4-dinitro-fluoro-fenilo
degradacion de edman
reactivo de edman
fenilisotiocianato
se obtiene la feniltiohidantoína del aa N-terminal y queda el resto del peptido intacto
espectro de masas
información bidimensional que representa la abundancia de los diferentes tipos de iones en funcion de la relacion masa/carga de cada uno de ellos
el espectro de masas evidencia la relacion masa carga (m/z) de peptidos analizados y se convierte en
una huella digital de la proteina analizada (mass finger printing)
componentes básicos para espectrometria de masas
-sistema de ionizacion
-analizador de masas
-detector de iones
sistema de ionización
MALDI
muestras en fase sólida
sistema de ionización
ESI
electrospray ionization
muestras en fase líquida
analizadores de masa
-TOF (time of fligth)
-TOF-TOF
-trampa de iones tridimensional (ion trap)
-Q (quadrupolo)
TOF
la muestra de iones se acelera antes de entrara al tubo de tiempo de vuelo (TOF)
para una energía determinada, los iones más pesados se desplazaran más lento, el tiempo que tardan en atravesar el tubo nos dice su masa
TOF-TOF
se puede abrir y cerrar rápidamente la compuerta de paso entre el primer tubo (drift tube) y el TOF tube.
el aislamiento no funciona cuando es espectro está demasiado congestionado
Trampa de iones
los iones son atrapados aplicando una radiofrecuencia en la dirección radial y un potencial continuo repulsivo en la lente de salida
despues de q se acumulan, los iones salen de la trampa mediante un voltaje auxiliar
quadrupolo
cuatro barras metalicas de seccion circular o hiperbólica, rectas y paralelas
por pares alternos se aplica un potencial constante V que origina un movimiento lateral oscilante de iones
bajo ciertas condiciones de potencial, determinado ion puede moverse sin chocar con las barras e ingresar al detector
funciona como verdaero filtro de masas
MS/MS
esencialmente dos espectrómetros en tandem
metodo para determinar la estructura tridimensional de una macromolecula mediante el analisis del patrón de difraccion de los rayos x por un compuesto cristalino
cristalografia de rayos x
determina la separacion de los atomos en una red cristaliba midiendo las ubicaciones de manchas producidas en una pelicula fotografica por un haz de rayos x difractado
resolucion
distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas
depende de la LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ
a menor longitud de onda de lux, mayor resolución
