IVc purificación de proteínas Flashcards
cromatografia en papel
fase estacionaria: papel filtro
version primitiva de la capa fina
para aminoacidos individuales o dipeptidos
empleada por Sanger (1945) en la secuenciación d einsulina
cromatografia en capa fina
fase estacionaria: placa adsorbente
los mas usados: silica gel (SiO2) y aluminia (Al2O3), adherido a un soporte de plastico, vidrio o aluminio
HPLC
cromatografia liquida de alto rendimiento
liquido-liquido
cromatografia
intercambio cationico
resina carga negativa
fuerte— ácido sulfónico
débil— ácido carboxilico
cromatografia
intercambio anionico
resina carga positiva
fuerte —- aminas cuaternarias
debil—- aminas secundarias o terciarias
hplc
analítica
determinar la composicion de la mezcla
hplc
preparativa
se pueden recuperara los componentes posteriormente a su análisis para estudios posteriores
ej. espectrofotometria de masas -secuenciación-
herramienta fundamental para AISLAR Y PURIFICAR ACROMOLECULAS con base a su MOVILIDAD DENTRO DE UN SOPORTE O MATRÍZ SOLIDA EN UNA CAMPO ELÉCTRICO
electroforesis
dos tipos de muestras pueden ser analizadas: proteínas y acidos nucleicos
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electroforesis en gel de poliacrilamida
geles de poliacrilamida componentes
acrilamida + bisacrilamida
acrilamida
C3H5NO
formación de polímeros
bisacrilamida
N,N´-methylenebisacrilamida
C7H10N2O2
entrecruzamiento (cross - linking) entre las cadenas de polímeros
es la secuencia de una cadena de aa
estructura primaria de las proteinas
ocurre cuando lo saa en la secuencia interactuan a traves de enlaces hidrogeno
estructura secundaria de las proteinas
ocurre cuando ciertas atracciones están presentes entre hélices alfa hojas plegadas
estructura terciaria de las proteinas
es una proteina que consiste de más de una cadena de aa
estructura cuaternaria de las proteinas
***puentes disulfuro
aminoacido en proteinas que pueden formar enlaces puentes disulfuro
cisteína
ayudan a estabilizar estructuras terciarias y cuaternarias
1 molecula de SDS por cada 2 residuos de aminoacios
unos 1.4g SDS/ g proteina
análisis de proteinas multiméricas
agentes desnaturalizantes reductor
ditiotreitol (DTT) o B-mercaptoetanol
se puede determinar el numero y tamaño de subunidades proteicas comparando la electroforesis bajo condiciones reductoras y no reductoras
azul de bromofenol
se adiciona al buffer de carga de la muestra
permite visualizar el corrimiento electroforético
carga negativa por encima de ph 4.6
peso molecular menor que cualquier proteina
revelado del gel
azul de coomassie
puede detectar bandas de hasta 50 ng
revelado del gel
tinción de plata
silver stainning
incrementa la sensibilidad de detección (50x)
punto isoelectrico
es el ph al que un polianfólito tiene como carga 0
moleculas grande como las proteinas que tienen muchos frupos acidos o basicos (ionizables/ protonables)
polianfolitos
una molecula con un PI bajo tendra predominante
grupos acidos
un PI alto indica predominancia de
gupos basicos
los puntos isoelectricos de las diferentes proteinas van en función al
ph
al cual actua la proteina
proteómica cuantitativa
estudio de las variaciones de los NIVELES DE EXPRESION A NIVEL DE PROTEINA en determinados momentos y bajo ciertas condiciones de la célula que permite identificar aquellas proteínas cuya presencia, ausencia o alteración se correlaciona con determinados estados fisiologicos
en el analisis proteomico asociado a patologias concretas:
es posible identificar proteinas que permiten diagnosticar la enfermedad o pronosticar la evolucion de la misma. Dichas proteinas se conocen con el nombre genérico de biomarcadores
