Ve hibridación de acidos nucleicos Flashcards
simple y poderosa forma de detectar secuencias específicas de nucleotidos empleando sondas (material genético) marcadas
hibridacion de acidos nucleicos
los acidos nucleicos involucrados proceden de fuentes dif. previamente no formaban:
una doble cadena
las sondas son de cadena sencilla y su reconocimiento es altamente especifico
v o f
verdadero
ej sonda de 30nt. la secuencia espcifica estaria presente al azar en un genoma, una vez cada 4^30 (1.15x10^18) nt. cada genoma humano 3x10^9. poco probable q esté simplemente al azar
tipos de hibridación
-hibridación in situ (FISH)
-southern Blot (DNA)
-northern blot (RNA)
-dot blot
-hibridación de coonias o placas
tecnica de marcaje de cromosoma q permite mapear la ubicación relativa de secuencias dif a lo largo de secuencias unicas de adn mediante la hibridación de sondas q emiten fluorescencia
fluorescent in situ hybridization (FISH)
desarrollada inicialmente en 1969 con marca radiactiva
FISH
se realiza cuando se sospecha de una anormalidad cromosómica en algún síndrome concreto habiendo excluido otras posibilidades no genéticas
FISH
*tmbn permite localizar la expresión génica en un tejido
proceso para el FISH
Cromosoma mitotico, dna bicatenario en portaobjetos
-portaobjetos tratado con solución salina caliente para desnaturalizar el DNA
DNA monocatenario
-incubación con sonda de DNA biotinilado y lavado para eliminar el DNA no hibrido. en este ej se utiliza dna satelite
hibrido de dna bicantenario
-incubación con avidina marcada con fluorescencia para revelar la localización de la sonda d DNA marcada. la contratinción de los cromosomas hace q aprezcan en color rojo
localización de DNA satelite en los centromeros
———contratincion por ej con IOUDRO DE PROPIDIO
Algunos tipos de sondas
1- especifica de locus
2- fusión dual
3- doble color para ruptura
4- centromericas
5- teloméricas
sonda especifica de locus*
anomalias cromosomicas numericas (aneuploidías)
-monosomias
-trisomias
-especificas para una región cormosomica unica
-en la imagen se deben ver 2 señales por núcleo
sonda especifica de locus*
anomalias cromosomicas estructurales
-delecion: se pierde o se elimina parte del cromosoma
-duplicación: se duplica parte del cromosoma
una delecion o duplicación de la región cromosómica dará origen a una señal o más de dos señales, respectivamente
tipo de sonda q se unen a regiones contiguas al punto de translocación
fusión dual
translocacion
anomalia cromosomica estructural
se transfiere una parte de un cromosoma a otro
como seran observadas las translocaciones en la fusion dual?
sera observada como una señal conjunta
sondas q revelan eventos de translocacion
doble color para ruptura
se unen al cromosoma intacto flanqueando el punto de ruptura
doble color para ruptura
*cuando las translocación ocurre, la sonda se separa
sondas q hibridan en las regiones repetidas q rodean los centrómeros
centromericas (satelites)
*pueden tmbn detectar aneuploidia de cualquier cromosoma
para q son utiles las sondas teloméricas?
utiles para revelar pequeñas deleciones o translocaciones q no son fáciles de visualizar en el cariotipo estándar
cual es el objetivo de northern blot, southern blot
identificar secuencias de interés en el ácido nucleioco inmovilizado en una matriz de papel, nylon o nitrocelulosa
*la transeferencia puede ser pasiva o electrotransferencia
ej. dna genómico digerido previamente con enzimas de restricción
southern blot
ej. analisis de expresión. niveles de RNAm
northern blot
sonda marcada o acoplada a una etiqueta
ejemplos
-fosforo radioactivo (^32P)
-digoxigenina (DIG)
*anticuerpos especificos aDIG
*anticuerpo acoplado a fosfatasa alcalina
*sustrato quimioluminiscente. CSPD (disodium 3-(4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3,2´-(5´-chloro) tricyclo (3.3.1.1 decan)-4-yl) phenyl phosphato)
en southern blot se debe de considerar la muestra q se está analizando y lo que…
representa el q haya o no reconocimiento específico de la sonda empleada
nivel de expresión de un gen relacionado con el cuadro clínico
northern blot
analisis de expresión de genes
ej
-niveles de la proteína (proteoma)
-niveles de mRNA
*RT-qPCR
*northern blot
*microarreglos
util en muestras de adn como de rna
en vez de hacer la separación electroforetica en gel de cada una de las muestras, estas se aplican con un capilar en la membrana directamente
dot blot
permite analizar de forma rápida la presencia de una secuencia específica en una muestra determinada
dot blot
hibridacion de colonias o placas*
la membrana se pone en contacto con:
las colonias
hibridacion de colonias o placas*
la membrana se trata de forma q se promueve q el DNA o RNA quede:
expuesto y pueda hibridar con la sonda marcada
*la colonia identificada de esta forma puede ser resembrada y expandida
