Va extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards
primer paso de la tecnología de DNA recombinante
aislamiento de DNA
DNA en eucariotas está asociado a proteínas
v o f
verdadero
son compartimentos delimitados y rodeados por membranas
adn en la célula eucariota
pasos para la extracción de ADN genómico
- muestra de células
- añadir buffer de lisis para mantener el pH, romper membranas, desnaturalizar y degradar proteínas
- precipitación de proteínas
- precipitación ADN con alcohol frío y altas concentraciones de sal
- lavados
- resuspensión en agua libre de nucleasas
- cuantificación y determinación de la pureza
*sangre
CMSP
celulas mononucleares de sangre preriferica
q contiene el buffer de lisis?
-50mM Tris-HCl, pH 8.0
-1% SDS (Dodecil Sulfato de Sodio)
-Proteasa. Proteinasa K (2mg/ml)
buffer lisis*
buffer para mantener el pH en el cual el DNA se mantiene estable y con carga negativa
50mM Tris-HCl, pH 8.0
buffer lisis*
detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación del DNA
desnaturaliza proteinas (inactivando por ej DNAsas) dejandolas accesibles para la proteasa
1% SDS (Dodecil Sulfato de Sodio)
Cuando el SDS entra en contacto con la célula, captura…
lipidos y proteinas
*el acido nucleico permanece en solucion
serina proteasa activa bajo condiciones desnaturalizantes
proteinasa K
aislada del hongo Tritirachium album
proinasa k
altamente activa sobre proteinas nativas y desnaturalizadas
capaz de inactivar las RNAsas y las DNAsas
proteinasa K
destruir proteinas que crean un enlace con el DNA (ej. histonas, factores de transcripcion, polimerasas)
proteinasa K
al poner proteinasa K, q incrementa?
-la pureza del ADN, menor contaminación por proteínas
-la calidad/cantidad de DNA no degradado
ejemplo de solucion que precipita proteinas
soluciones de acetona
las proteínas de insolubilizan y precipitan
las proteinas se pueden separar por centrifugación, quedando en el precipitado (pellet), junto con los restos celulares, entonces en el sobrenadante se encuentra:
el acido nucleico
la precipitación del DNA se hace a altas concentraciones de:
sales (NaCl)
*los iones Na neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato
*las moleculas de DNA se juntan en lugar de repelerse una a la otra
*se disminuye la solubilidad del DNA en el ambiente acuoso
molecula menos polar que el agua
es miscible con el agua
alcohol frío (etanol)
el DNA es soluble en etanol por lo que al agregarse a la solución de ácidos nucleicos anteriormente obtenida, el DNA precipita
v o f
falso
el DNA no es soluble con el etanol
que es más polar, el RNA o DNA
RNA
el RNA no precipita
al disminuir la temperatura el DNA se insolubiliza aún más (incubación en hielo)
v o f
verdadero
*las moleculas de DNA insolubilizado parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraña
para la precipitación del DNA se hace la centrifugación a temperatura
fría
se obtiene una pastilla (pellet) blanco compacto en el fondo del tubo
cómo se realizan los lavados?
se lava un par de veces con soluciones de etanol al 75%, lo cual remueve las sales y otras impurezas sin disolver el DNA
cómo se resuspende el DNA
se solubiliza en agua libre de nucleasas (ej 25-100ul)
-concentracio y pureza
los espectros de absorbancia de ácidos nucleicos y proteinas (compuestos aromaticos, fenoles) muestra niveles máximos a:
260nm y 280nm respectivamente
calcula la concentración de ácidos nucleicos en la solución con base a la absorbancia a 260nm
espectrofotómetro
la pureza se determina mediante el coeficiente
260/280
valores optimos de pureza de ADN
1.8 - 2.0
valores aceptable de pureza de ADN
1.6 - 1.8
valores de contaminación con compuestos aromáticos y proteínas en la pureza de ADN
<1.6
valores donde hay contaminación con ARN en la pureza de ADN
> 2.1
Método para extracción de ARN
método del Fenol-Cloroformo (inicialmente en fase continua)
extraccion RNA*
paso 1
rompe membranas, desnaturaliza proteinas y libera los ácidos nucleicos de moleculas asociadas
extracción rna*
q hace la adición de más cloroformo?
(paso 2)
separa las fases
q es más polar, el fenol o el cloroformo?
fenol
cloroformo es inmiscible en agua
extraccion rna
dónde queda el ADN ?
(paso 2)
el ADN menos polar que el ARN se queda entre las fases acuosa y fenólica junto con las proteínas
*el RNA permanece disuelto en la fase acuosa
extracción de arn*
paso 3
se retira la fase acuosa y en otro tubo se le adiciona alcohol (isopropanol) frío
el isopropanol es un alcohol menos polar q el etanol
extracción rna*
pasos 4,5,6 y 7
- centrifugar
- lavar el pellet EtOH 75%
- resuspender RNA
- coeficiente 260/280
valor aceptable en pureza del RNA
> 1.7
valor óptimo en pureza del RNA
2.0 - 2.2
valor con contaminación con compuestos aromaticos y proteínas en la pureza de ARN
<1.7
formas de purificación de acidos nucleicos
-cromatografía de afinidad
-electroforesis: convencional, de campo pulsado y capilar
tipo de cromatografía para separar ácidos nucleicos
de afinidad
ej. mRNA
tipo de gel donde el
analisis principalmente de muestras de proteínas, aunque tambn para ácidos nucleicos es posible en caso de q se requiera mayor resolución que la que brinda la agarosa
geles de poliacrilamida
tipo de gel
analisis de muestras de acidos nucleicos. en ________ no pueden ser observadas diferencias pequeñas (p. ej. 20pb) en pesos moleculares de las moleculas analizadas
geles de agarosa
-convencional
-campo pulsado
factores intrinsecos a la partícula en movilidad electroforética
-relación carga/masa
-peso molecular
factores extrínsecos a la partícula en movilidad electroforética
-concentración de agarosa
-voltaje aplicado
-tiempo de corrida
-temperatura
polisacarido formado por B-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa y a-(1-3)-D-galactosa
soluble en agua a teperatruras superiores a 65°
forma una matriz inerte y no tóxica
agarosa
concentración de agarosa típica
0.5 a 4% (peso/volumen)
la movilidad disminuye al aumentar el porcentaje de agarosa
v o f
verdadero
voltaje típico aplicado
10 V/cm de gel
geles de 10-15cm : 100V-130V
al incrementar el voltaje la_____ aumenta
movilidad
*aunque no necesariamente se incrementa tambn la resolución
voltajes para mejor resolución
5 V/cm de gel
voltajes menores (ej 70V)
a menor voltaje mayor difusión lateral
v o f
verdadero
a mayor tiempo de corrida, mayor:
resolución
precaución: que no se salga la muestra del gel
q ocurre si se incrementa la temperatura en la electroforesis?
la movilidad se incrementa como si se hubiera disminuido la concentración de agarosa
precaución: si la temperatura se incrementa mucho se puede fundir el gel
normalmente la temperatura se mantiene lo más baja posible
si incrementa el voltaje e incrementa el tiempo de corrida:
la temperatura y la movilidad aumenta
revelado, visualizacion a n*
sustancia q se intercala entre las bases, detecta hasta 1ng de dsDNA, en la agarosa o post-corrida
bromuro de etidio
a cuantos nm de UV se absorbe el bromuro de etidio
260-360nm
y emite fluorescencia rojo-naranja (560 nm)
revelado. visualizacion a n*
sustancia no intercalante. alternativa menos toxica aunque menos sensible (3ng)
SYBR
mezcla de moleculas (acido nucleico), de diferente peso molecular que sirve como referencia para el analisis cualitativo (determinación del peso molecular aproximado de una banda especifica) de las muestras analizadas
marcadores de peso molecular
los marcadores de peso molecular pueden ser:
-sintéticos (ej 100pb, 1kb)
-DNA de fagos o plásmidos por ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (endonucleasas específicas de secuencias)
analisis cualitativo*
por qué se habla de PESO MOLECULAR APARENTE?
pq no se puede conocer el número exacto de pb de las bandas e corrimiento de las muestras
diferencias pequeñas (ej 20pb) en pesos moleculares entre dos bandas pueden ser distinguidas en agarosa
v o f
falso
NO pueden ser distinguidos en agarosa
EMSA
electrophoresis mobility shift assay
basada en la interacción entre ácidos nucleicos y proteínas
*EMSA
analisis de retraso en el gel
los complejos ácidos nucleicos-proteinas tienen un peso molecular mayor por lo cual la movilidad del ácido nucleico correspondiente …
disminuye (se retrasa su avance en el gel)
*analisis de retraso en gel
permite detectar interacciones entre la secuencia especifica de acido nucleico (ej TFBS) y alguna proteína funcional particular (ej factor de transcripcion)
*EMSA
analisis de retraso en gek
para una mayor resolucion se emplea:
-voltaje menor
-mayor tiempo de corrida
-posiblemente un % mayor de agarosa
separación de grandes fragmentos de DNA (hasta millones de bases)
reorientación de la molécula mediante cambios periódicos en la orientación del campo eléctrico (E1 y E2)
electroforesis en gel de campo pulsado
campo pulsado*
al aplicar E1 las cadenas de DNA:
se estiran y orientan en esa dirección
campo pulsado*
al aplicar E2 más o menos perpendicular a E1:
se obliga a las cadenas de DNA a relajarse, elongarse y alinearse en una nueva dirección
campo pulsado*
a las cadenas más cortas les toma menos tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad
v o f
verdadero
campo pulsado*
cómo es la aplicación de campos eléctricos?
sucesiva
E1/E2/E1/E2/E1/E2…
campo pulsado*
grados del ángulo alfa de reorientación (entre E1 y E2)
mayor a 100°
campo pulsado*
para evitar q el DNA se fragmente al cargar la muestra se utilizan:
disoluciones concentradas de alta viscosidad o incluso células completas q lo contienen
-usualmente el DNA genomico se digiere con enzimas de restriccion previo al corrimiento electroforético
geometria instrumentos PFGE*
campos electricos NO homogeneos:
alfa va incrementandose
-PFGE. pulsed field gradient electrophoresis
-OFAGE. orthogonal field-alternating gel
-TAFE. transverse alternating-field
geometria instrumentos PFGE*
campos electricos homogeneos:
alfa permanece constante
-FIGE. filed inversion gel electrophoresis
-CHEF. contour-clamped homogeneous electric field
-RGE: rotating gel electrophoresis
PFGE*
cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de DNA a separar, mayor es la duración de los pulsos aplicados y __________ el voltaje
menor
*la duración del pulso va desde fracciones de segundo hasta varias horas
electroforesis con
capilares de sílice (SiO2) flexibles recubiertos de poliamidas
electroforesis capilar
electroforesis capilar tiene un campo electrico alto:
100-500 V/cm
electroforesis q permite obtener resultados en corto tiempo (5-60 min) y se ocupa un minimo de muestra (nL)
electroforesis capilar
*muy empleada en la secuenciación automatizada
electroforesis capilar tiene una resolución muy:
alta
1 nucleotido de diferencia
cuál tiene mayor peso molecular, el DNA del gen discontinuo o el cDNA q corresponde al mRNA?
el DNA del gen discontinuo pq tiene intrones
el cDNA carece de intornes (menor peso molecular)
dna genómico*
la corriente eléctrica transmite su energía a un sistema mecánico q la convierte en vibraciones de alta densidad q generan ondas de ultrasonido y vibración. en el liquido se generan millones de burbujas microscópicas, las cuales sufren rapidísimos procesos de expansión y colapso
lisis celular por sonicación
dna genomico*
degradación por accion de :
DNAsas durante la extacción, etc
