Va extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos

Question 1

primer paso de la tecnología de DNA recombinante

Answer 1

aislamiento de DNA

Question 2

DNA en eucariotas está asociado a proteínas
v o f

Answer 2

verdadero

Question 3

son compartimentos delimitados y rodeados por membranas

Answer 3

adn en la célula eucariota

Question 4

pasos para la extracción de ADN genómico

Answer 4

1. muestra de células
2. añadir buffer de lisis para mantener el pH, romper membranas, desnaturalizar y degradar proteínas
3. precipitación de proteínas
4. precipitación ADN con alcohol frío y altas concentraciones de sal
5. lavados
6. resuspensión en agua libre de nucleasas
7. cuantificación y determinación de la pureza

Question 5

*sangre
CMSP

Answer 5

celulas mononucleares de sangre preriferica

Question 6

q contiene el buffer de lisis?

Answer 6

-50mM Tris-HCl, pH 8.0
-1% SDS (Dodecil Sulfato de Sodio)
-Proteasa. Proteinasa K (2mg/ml)

Question 7

buffer lisis*
buffer para mantener el pH en el cual el DNA se mantiene estable y con carga negativa

Answer 7

50mM Tris-HCl, pH 8.0

Question 8

buffer lisis*
detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación del DNA
desnaturaliza proteinas (inactivando por ej DNAsas) dejandolas accesibles para la proteasa

Answer 8

1% SDS (Dodecil Sulfato de Sodio)

Question 9

Cuando el SDS entra en contacto con la célula, captura…

Answer 9

lipidos y proteinas

*el acido nucleico permanece en solucion

Question 10

serina proteasa activa bajo condiciones desnaturalizantes

Answer 10

proteinasa K

Question 10

aislada del hongo Tritirachium album

Answer 10

proinasa k

Question 11

altamente activa sobre proteinas nativas y desnaturalizadas
capaz de inactivar las RNAsas y las DNAsas

Answer 11

proteinasa K

Question 12

destruir proteinas que crean un enlace con el DNA (ej. histonas, factores de transcripcion, polimerasas)

Answer 12

proteinasa K

Question 13

al poner proteinasa K, q incrementa?

Answer 13

-la pureza del ADN, menor contaminación por proteínas
-la calidad/cantidad de DNA no degradado

Question 14

ejemplo de solucion que precipita proteinas

Answer 14

soluciones de acetona

las proteínas de insolubilizan y precipitan

Question 15

las proteinas se pueden separar por centrifugación, quedando en el precipitado (pellet), junto con los restos celulares, entonces en el sobrenadante se encuentra:

Answer 15

el acido nucleico

Question 16

la precipitación del DNA se hace a altas concentraciones de:

Answer 16

sales (NaCl)

*los iones Na neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato
*las moleculas de DNA se juntan en lugar de repelerse una a la otra
*se disminuye la solubilidad del DNA en el ambiente acuoso

Question 17

molecula menos polar que el agua
es miscible con el agua

Answer 17

alcohol frío (etanol)

Question 18

el DNA es soluble en etanol por lo que al agregarse a la solución de ácidos nucleicos anteriormente obtenida, el DNA precipita
v o f

Answer 18

falso

el DNA no es soluble con el etanol

Question 19

que es más polar, el RNA o DNA

Answer 19

RNA

el RNA no precipita

Question 20

al disminuir la temperatura el DNA se insolubiliza aún más (incubación en hielo)
v o f

Answer 20

verdadero

*las moleculas de DNA insolubilizado parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraña

Question 21

para la precipitación del DNA se hace la centrifugación a temperatura

Answer 21

fría

se obtiene una pastilla (pellet) blanco compacto en el fondo del tubo

Question 22

cómo se realizan los lavados?

Answer 22

se lava un par de veces con soluciones de etanol al 75%, lo cual remueve las sales y otras impurezas sin disolver el DNA

Question 23

cómo se resuspende el DNA

Answer 23

se solubiliza en agua libre de nucleasas (ej 25-100ul)

Question 24

-concentracio y pureza los espectros de absorbancia de ácidos nucleicos y proteinas (compuestos aromaticos, fenoles) muestra niveles máximos a:

Answer 24

260nm y 280nm respectivamente

Question 25

calcula la concentración de ácidos nucleicos en la solución con base a la absorbancia a 260nm

Answer 25

espectrofotómetro

Question 26

la pureza se determina mediante el coeficiente

Answer 26

260/280

Question 27

valores optimos de pureza de ADN

Answer 27

1.8 - 2.0

Question 28

valores aceptable de pureza de ADN

Answer 28

1.6 - 1.8

Question 29

valores de contaminación con compuestos aromáticos y proteínas en la pureza de ADN

Answer 29

<1.6

Question 30

valores donde hay contaminación con ARN en la pureza de ADN

Answer 30

>2.1

Question 31

Método para extracción de ARN

Answer 31

método del Fenol-Cloroformo (inicialmente en fase continua)

Question 32

extraccion RNA* paso 1

Answer 32

rompe membranas, desnaturaliza proteinas y libera los ácidos nucleicos de moleculas asociadas

Question 33

extracción rna* q hace la adición de más cloroformo? (paso 2)

Answer 33

separa las fases

Question 34

q es más polar, el fenol o el cloroformo?

Answer 34

fenol cloroformo es inmiscible en agua

Question 35

extraccion rna dónde queda el ADN ? (paso 2)

Answer 35

el ADN menos polar que el ARN se queda entre las fases acuosa y fenólica junto con las proteínas *el RNA permanece disuelto en la fase acuosa

Question 36

extracción de arn* paso 3

Answer 36

se retira la fase acuosa y en otro tubo se le adiciona alcohol (isopropanol) frío el isopropanol es un alcohol menos polar q el etanol

Question 37

extracción rna* pasos 4,5,6 y 7

Answer 37

4. centrifugar 5. lavar el pellet EtOH 75% 6. resuspender RNA 7. coeficiente 260/280

Question 38

valor aceptable en pureza del RNA

Answer 38

>1.7

Question 38

valor óptimo en pureza del RNA

Answer 38

2.0 - 2.2

Question 39

valor con contaminación con compuestos aromaticos y proteínas en la pureza de ARN

Answer 39

<1.7

Question 40

formas de purificación de acidos nucleicos

Answer 40

-cromatografía de afinidad -electroforesis: convencional, de campo pulsado y capilar

Question 41

tipo de cromatografía para separar ácidos nucleicos

Answer 41

de afinidad ej. mRNA

Question 42

tipo de gel donde el analisis principalmente de muestras de proteínas, aunque tambn para ácidos nucleicos es posible en caso de q se requiera mayor resolución que la que brinda la agarosa

Answer 42

geles de poliacrilamida

Question 43

tipo de gel analisis de muestras de acidos nucleicos. en ________ no pueden ser observadas diferencias pequeñas (p. ej. 20pb) en pesos moleculares de las moleculas analizadas

Answer 43

geles de agarosa -convencional -campo pulsado

Question 44

factores intrinsecos a la partícula en movilidad electroforética

Answer 44

-relación carga/masa -peso molecular

Question 45

factores extrínsecos a la partícula en movilidad electroforética

Answer 45

-concentración de agarosa -voltaje aplicado -tiempo de corrida -temperatura

Question 46

polisacarido formado por B-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa y a-(1-3)-D-galactosa soluble en agua a teperatruras superiores a 65° forma una matriz inerte y no tóxica

Answer 46

agarosa

Question 47

concentración de agarosa típica

Answer 47

0.5 a 4% (peso/volumen)

Question 48

la movilidad disminuye al aumentar el porcentaje de agarosa v o f

Answer 48

verdadero

Question 49

voltaje típico aplicado

Answer 49

10 V/cm de gel geles de 10-15cm : 100V-130V

Question 50

al incrementar el voltaje la_____ aumenta

Answer 50

movilidad *aunque no necesariamente se incrementa tambn la resolución

Question 51

voltajes para mejor resolución

Answer 51

5 V/cm de gel voltajes menores (ej 70V)

Question 52

a menor voltaje mayor difusión lateral v o f

Answer 52

verdadero

Question 53

a mayor tiempo de corrida, mayor:

Answer 53

resolución precaución: que no se salga la muestra del gel

Question 54

q ocurre si se incrementa la temperatura en la electroforesis?

Answer 54

la movilidad se incrementa como si se hubiera disminuido la concentración de agarosa precaución: si la temperatura se incrementa mucho se puede fundir el gel normalmente la temperatura se mantiene lo más baja posible

Question 55

si incrementa el voltaje e incrementa el tiempo de corrida:

Answer 55

la temperatura y la movilidad aumenta

Question 56

revelado, visualizacion a n* sustancia q se intercala entre las bases, detecta hasta 1ng de dsDNA, en la agarosa o post-corrida

Answer 56

bromuro de etidio

Question 57

a cuantos nm de UV se absorbe el bromuro de etidio

Answer 57

260-360nm y emite fluorescencia rojo-naranja (560 nm)

Question 58

revelado. visualizacion a n* sustancia no intercalante. alternativa menos toxica aunque menos sensible (3ng)

Answer 58

SYBR

Question 59

mezcla de moleculas (acido nucleico), de diferente peso molecular que sirve como referencia para el analisis cualitativo (determinación del peso molecular aproximado de una banda especifica) de las muestras analizadas

Answer 59

marcadores de peso molecular

Question 60

los marcadores de peso molecular pueden ser:

Answer 60

-sintéticos (ej 100pb, 1kb) -DNA de fagos o plásmidos por ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (endonucleasas específicas de secuencias)

Question 61

analisis cualitativo* por qué se habla de PESO MOLECULAR APARENTE?

Answer 61

pq no se puede conocer el número exacto de pb de las bandas e corrimiento de las muestras

Question 62

diferencias pequeñas (ej 20pb) en pesos moleculares entre dos bandas pueden ser distinguidas en agarosa v o f

Answer 62

falso NO pueden ser distinguidos en agarosa

Question 63

EMSA

Answer 63

electrophoresis mobility shift assay

Question 64

basada en la interacción entre ácidos nucleicos y proteínas

Answer 64

*EMSA analisis de retraso en el gel

Question 65

los complejos ácidos nucleicos-proteinas tienen un peso molecular mayor por lo cual la movilidad del ácido nucleico correspondiente ...

Answer 65

disminuye (se retrasa su avance en el gel) *analisis de retraso en gel

Question 66

permite detectar interacciones entre la secuencia especifica de acido nucleico (ej TFBS) y alguna proteína funcional particular (ej factor de transcripcion)

Answer 66

*EMSA analisis de retraso en gek

Question 67

para una mayor resolucion se emplea:

Answer 67

-voltaje menor -mayor tiempo de corrida -posiblemente un % mayor de agarosa

Question 68

separación de grandes fragmentos de DNA (hasta millones de bases) reorientación de la molécula mediante cambios periódicos en la orientación del campo eléctrico (E1 y E2)

Answer 68

electroforesis en gel de campo pulsado

Question 69

campo pulsado* al aplicar E1 las cadenas de DNA:

Answer 69

se estiran y orientan en esa dirección

Question 70

campo pulsado* al aplicar E2 más o menos perpendicular a E1:

Answer 70

se obliga a las cadenas de DNA a relajarse, elongarse y alinearse en una nueva dirección

Question 71

campo pulsado* a las cadenas más cortas les toma menos tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad v o f

Answer 71

verdadero

Question 72

campo pulsado* cómo es la aplicación de campos eléctricos?

Answer 72

sucesiva E1/E2/E1/E2/E1/E2...

Question 73

campo pulsado* grados del ángulo alfa de reorientación (entre E1 y E2)

Answer 73

mayor a 100°

Question 74

campo pulsado* para evitar q el DNA se fragmente al cargar la muestra se utilizan:

Answer 74

disoluciones concentradas de alta viscosidad o incluso células completas q lo contienen -usualmente el DNA genomico se digiere con enzimas de restriccion previo al corrimiento electroforético

Question 75

geometria instrumentos PFGE* campos electricos NO homogeneos: alfa va incrementandose

Answer 75

-PFGE. pulsed field gradient electrophoresis -OFAGE. orthogonal field-alternating gel -TAFE. transverse alternating-field

Question 76

geometria instrumentos PFGE* campos electricos homogeneos:

Answer 76

alfa permanece constante -FIGE. filed inversion gel electrophoresis -CHEF. contour-clamped homogeneous electric field -RGE: rotating gel electrophoresis

Question 77

PFGE* cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de DNA a separar, mayor es la duración de los pulsos aplicados y __________ el voltaje

Answer 77

menor *la duración del pulso va desde fracciones de segundo hasta varias horas

Question 78

electroforesis con capilares de sílice (SiO2) flexibles recubiertos de poliamidas

Answer 78

electroforesis capilar

Question 79

electroforesis capilar tiene un campo electrico alto:

Answer 79

100-500 V/cm

Question 80

electroforesis q permite obtener resultados en corto tiempo (5-60 min) y se ocupa un minimo de muestra (nL)

Answer 80

electroforesis capilar *muy empleada en la secuenciación automatizada

Question 81

electroforesis capilar tiene una resolución muy:

Answer 81

alta 1 nucleotido de diferencia

Question 82

cuál tiene mayor peso molecular, el DNA del gen discontinuo o el cDNA q corresponde al mRNA?

Answer 82

el DNA del gen discontinuo pq tiene intrones el cDNA carece de intornes (menor peso molecular)

Question 83

dna genómico* la corriente eléctrica transmite su energía a un sistema mecánico q la convierte en vibraciones de alta densidad q generan ondas de ultrasonido y vibración. en el liquido se generan millones de burbujas microscópicas, las cuales sufren rapidísimos procesos de expansión y colapso

Answer 83

lisis celular por sonicación

Question 84

dna genomico* degradación por accion de :

Answer 84

DNAsas durante la extacción, etc