IVa cultivo celular Flashcards
conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológvicas, bioquímicas y genéticas
cultivo celular
a que se refiere in vitro
a una técnica para realizar un determinado experimento en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo
cultivo bacteriológico
-microrganismos
-bacterias, hongos y parásitos
cultivo celular
- celulas eucariotas (ej. organismos pluricelulares)
- protozoarios (paramecios, plasmodium, amebas)
-levaduras (hongos microscopicos unicelulares)
en medicina se referiría a celulas representantes de un tipo celular específico (humano o especie de interés)
fase de latencia
tiempo que tarda en comenzar el crecimiento de un microorganismo tras ser inoculado en medio fresco
depende de la historia del inoculo, la naturaleza del medio y las condiciones de crecimiento
fase latencia
si un cultivo en fase exponencial se transfiere a un medio fresco bajo las mismas condiciones de crecimiento:
no hay esencialemente fase de latencia y prosigue en fase exponencial
fase latencia
si el inóculo proviene de un cultivo viejo:
las células están depletas de constituyentes esenciales para el crecimiento, se llevara tiempo sintetizarlos
fase latencia
si el medio cambia y se disponen de otros sustratos como fuentes de carbono por ejemplo, :
se requiere sintetizar las enzimas que permitirán aprovecharlo, eso lleva tiempo
estado más saludable de las células
fase exponencial
ideal para el estudio de enzimas u otros componentes celulares
fase exponencial
el numero de celulas se duplica en intervalos constantes de tiempo
en un cultivo por lote (tubo cerrado), los organismos no crecen indefinidamente de forma exponencial
un cultivo solamente permanece en fase exponencial por un tiempo limitado
menos de 10 generaciones
1 bacteria pesa 1 x 10-15 kg
fase estacionaria
comienza por agotamiento de nutrientes o acumulación de desechos
crecimiento críptico en la fase estacionaria
no hay incremento neto en el numero de células. algunas crecen mientras otras mueren
fase de muerte
tambien es exponencial, pero típicamente más lenta que la exponencial de crecimiento
las células pueden permanecer viables durante meses o incluso años
monitoreo del rendimiento de cultivos por espectrofotometría
celulas dispersan luz
la turbidez de una suspension celular aumenta en medida en q hay más celulas presentes
se mide la luz que atraviesa la suspensión sis ser dispersada
dos organismos pueden tener densidades ópticas dif a tiempos similares de medición por diferencias en tamaños, formas o velocidades de crecimiento:
el mismo valos de densidad óptica NO necesariamente correponte al mismo numero de celulas
espectro
cuando la turbidez es excesiva:
se pierde la correspondencia entre el numero de celulas y la densidad optica pq la luz dispersada de la fotocelda por una celula puede ser nuevamente enviada a la fotocelda por otra celula
ha sido considerada como mezcla de ciencia y arte
cultivo celular
gracias a que se ha desarrollado el cultivo celular?
-medios de cultivo (mucho más complejos que para cultivo bacteriológico)
-disponibilidad de antibióticos
-instalaciones aséptica (salas, cabinas de flujo laminar, incubadoras)
-dispositivos de cultivo (frascos T, caja petri)
medios de cultivo
tamponados para mantener un ph alrededor de 7.4
-indicadores de ph (rojo fenol), cambian de color a medida que aparecen catabolitos ácidos resultando del metabolismo celular
-antibioticos (ej penicilina, estreptomicina) y antimióticos (anfotericina) para impedir contaminación
mezcla poco definida de macromoléculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo
medio de cultivo con suero
quimicamente definidos con moleculas necesarias para la supervivencia y proliferación como los factores de crecimiento
medios de cultivo libres de suero
condiciones de cultivo celular
incubación a 37°C en una atmosfera de 5% CO2, 95% aire
frasco T
recipiente típico de 175 cm2 que puede contener aprox 1x10^7 células adheridas, y unas 1x10^8 celulas cuando se trata de lineas que crecen en suspensión
cultivos primarios
-se preparan DIRECTAMENTE DEL TEJIDO U ORGANO
-con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares
-celulas conservan sus caracteristicas originales y su PROLIFERACION ES LIMITADA
-pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios
cultivo primario
monocapa
-mayoría de células que forman los tejidos no pueden vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida sobre la cual crecer y multiplicarse (ANCLAJE - DEPENDIENTES)
-excepto celulas hematopoyeticas maduras
-este soporte es la base de una placa o frasco de plástico
el área de anclaje disponible se haya toda cubierta de células
confluencia
/cultivo primario monocapa
a veces los requerimientos son más complejos y el plástico debe recubrirse con:
COMPONENTES DE LA MATRIZ EXTRACELULAR que rodea a las células en los tejidos, como por ejemplo colageno y laminina
cultivos secundarios
las celulas en monocapa confluente detienen su crecimiento hasta que se las subcultiva (resiembra) a un recipiente con medio fresco
las celulas frecuentemente mostrarán distintas propiedades según su origen
lineas celulares
transformacion
inmortales, crecimiento aberrante (sin inhibición por contacto, ni anclaje-dependientes), malignas (diseminan e invaden), geneticamente inestables
-ej. se puede inmortalizar un fibroblasto si se les provee el gen q codifica para telomerasa
no todas las células humans se transforman asi
-otra forma es introducir ciertos oncogenes obtenidos de virus (ej HPV)
las celulas de los roedores experimentan cambios genéticos espontaneos que:
las inmortalizan cuando son cultivadas
HeLa
Henrietta Lacks
1952
primera línea celular humana. Adenocarcinoma
ventajas del cultivo celular
condiciones controladas, representan tipos celulares especificos, acreditación de su pureza, reproducibilidad experimental, consumo reducido de reactivos, utiles en las primeras etapas de la investigación (modelo más sencillo) que evita el uso de animales, pueden ser conservadas y almacenadas en nitrógeno líquido (a -196°C) por un largo tiempo reteniendo su viabilidad
desventajas del cultivo celular
se requiere experiencia para evitar contaminación y/o mala identificación, espacio de trabajo y equipos especializados, manejo de desechos plasticos y biológicos peligrosos, inestabilidad genetica (heterogeneidad), perdida de diferenciación
premio nobel de medicina 1984
cesar milsten
hibridomas
producción de anticuerpos monoclonales
-fusión de linfocitos B secretores de inmunoglobulinas (anticuerpos) y células derivadas de una línea tumoral de linfocitos B
fusógeno
ej POLIETILENGLICOL
***permite las membranas estén muy cerca y se fusionen
heterocarionte
célula con núcleos geneticamente diferentes separados pero con los contenidos citoplasmáticos compartidos
medio selectivo HAT
HAT
hipoxantina, aminopterina y timidina
aminopterina
es un antagonista competitivo del ácido dihidrofólico, vitamina necesaria para la sintesis de nucleotidos
-las celulas deben utilizar vías alternas para la síntesis de dna
estas vias alternas son defectivas en la linea celular tumoral pero estan intacta en la células del bazo. SOLO CÉLULAS HÍBRIDAS SOBREVIVEN
HGPRT
hipoxantina guanina fosforibosil transferasa
TQ
timidinoquinasa
un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo:
una célula híbrida en la cual las envolturas de ambos núcleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un único gran núcleo
anticuerpo monoclonal
reconoce un único antígeno epitope antigénico
