Vd secuenciación de DNA Flashcards
fue posible en los años 1970s gracias a la introducción de los métodos electroforeticos y el conocimiento de la química de los nucleotidos y del metabolismo del DNA
secuenciación del DNA
secuenciación del DNA*
el principio general era obtener…
cuatro juegos de fragmentos marcados, cada uno correspondientes a cada uno de las cuatro bases
en un principio se empleo marca radiactiva y posteriormente la fluorescencia
secuenciación de DNA
metodo quimico
Maxam y Gilbert (radiactividad)
siguiente generación (next-gen sequencing)
-454- pirosecuenciación
- illumina (terminador reversible)
metodo enzimaticos
-sanger (radiactividad)
-automatizada (variaación del de Sanger-fluorescencia)
metodos de secuenciación de adn
-metodo quimico
-metodos enzimaticos
-siguiente generación (next-gen sequencing)
-secuenciación por bisulfito
consiste en tres etapas fundamentales:
-marcaje del DNA
-hidrolisis quimica especifica del adn
-analisis de los productos
metodo de Maxam y Gilbert
metodo maxam y gilbert*
consiste en marcar el extremo 5´de cada hebra
lo más común es usar polinucleotido CINASA y ATP radiactivo
marcaje del ADN
metodo maxam y gilbert*
para obtener fragmentos de ADN de hebra sencilla, marcados, de longitud variable y que terminen en un nucleotido conocido
hidrolisis química especifica del ADN
maxam y gilbert - hidrolisis*
la muestra se divide en 4 alicuotas y cada una de ellas recibe tratamiento químico dif, con el fin de:
eliminar separadamente las bases puricas (G y A) y pirimidicas (C y T)
maxam y gilbert hidrolisis*
agentes quimicos utilizados para la G
dimetil sulfato
maxam y gilbert hidrolisis*
agente químico utilizado para C,T
hidrazina-piperidina
maxam y gilbert hidrolisis*
agente químico utilizado para A, G
ácido fórmico-dimetilsulfato-piperidina
maxam y gilbert hidrolisis*
agente químico utilizado para C
hidrazina-1.5M NaCl-piperidina
maxam y gilbert*
las 4 mezclas obtenidas se analizan por electroforesis
análisis de los productos
sanger*
se emplean __________________ ademas de los normales 2´-deoxinucleotido trifosfato (dNTPs)
´2´,3´-dideoxinucleotidos trifosfato (ddNTPs)
se basa en el mecanismo normal de la replicación del DNA
Metodo de Sanger
sanger*
la DNA polimerasa extiende la cadena de DNA debiendo estar presente en el grupo:
hidroxilo en el carbono 3´de la desoxirribosa (la polimerización ocurre solo en la dirección 3´)
sanger*
los ddNTPs carecen del grupo…
3´hidroxilo necesario para que se lleve a cabo la polimerización
sanger*
fragmentos de dif longitudes se generan por interrumpción de la:
polimerización cada vez q un ddNTP se incorpora a la cadena decreciente
sanger*
la polimerasa empleada deberá de carecer de la actividad 3´-5´exonucleasa de corrección
v o f
verdadero
los ddNTPs están marcados con fluorescencia en lugar de radiactividad (un color dif c/u)
secuencia automatizada
la reacción se lleva a cabo de uno solo tubo
la separación de los fragmentos de DNA se logra por electroforesis CAPILAR detectando en longitud de UN solo nucleotido
secuenciación automatizada
secuenciación automatizada*
los fragmentos más cortos estaran igualmente hacia el…
5´y los más largos se encontraran en la dirección 3
automatizada * fluorocromo
emisión: verde. derivado de fluoresencia
A - JOE
automatizada * fluorocromo
emisión: azul. derivado de fluoresencia
C-FAM
automatizada * fluorocromo
emisión: amarillo. derivado de rodamina
G-TAMRA
automatizada * fluorocromo
emisión: rojo. derivado de rodamina
T-ROX
reacción con ddNTPs marcados*
cada ddNTP está matrcado con un fluorocromo único que fluorece a una longitud de onda distinta (color), la reacción se hace en un solo:
tubo, ya q se puede distinguir entre ellos
grafico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis
electroferograma
se pueden compara la secuencia de una región específica (ej gen) en una persona portadora del polimorfismo/mutación q incluso puede estar sana en ese momento, con la secuencia control de una persona sana no portadora del polimorfismo/mutación asociada a la enfermedad
detección de un polimorfismo o mutación puntual
una reacción de secuenciación emplea un solo primer (cebador), lo q permite obtener la:
secuencia de Una de las cadenas
*en un analisis posterior se puede secuenciar la otra cadena empleando el otro primer especifico
permite secuenciar un genoma humano completo en un solo día o el de una bacteria en unas horas
454-pirosecuenciación
método de secuenciación de DNA en tiempo real basado en la liberación de los pirofosfatos (PPi) q tiene lugar en la reacción de polimerización del DNA a partir de sus dNTPs
454-pirosecuenciación
*no se requiere correr los fragmentos en un gel, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs
454-pirosecuenciación*
en genoma se fragmenta en cadenas de:
algunos cientos de pares de bases (300-800pb)
454-pirosecuenciación*
se ligan oligonucleotidos sintéticos A y B a los extremos:
A. para q la secuencia se una a una micro esfera (micro reactor)
B. para la amplificación (PCR en emulsión) y secuenciación. permiten la hibridación de un primer/cebador universal
pcr en emulsión*
cada esfera queda aislada en una gota acuosa rodeada de:
aceite y separada de las demas esferas
*al final aprox 2 millones de fragmentos de DNA idénticos en cada microesfera
preparación micromatriz*
las micro esferas se depositan en una microcelda con:
200,000 pocillos de 44um
una sola esfera por pozo
preparación micromatriz*
los pocillos se rellenan con:
esferas más pequeñas en las q se han inmovilizado enzimas para la secuenciación
pirosecuenciación*
enzima q incorpora dNTPs liberando PPi
DNA polimerasa
pirosecuenciación*
enzima para sintesis de ATP dependiente de PPi
sulfurilasa y su sustrato (adenosina 5´-fosfosulfato o APS)
pirosecuenciación*
enzima para la degradación de dNTPs no incorporados
aspirasa
pirosecuenciación*
enzima para la emisión de luz dependiente de ATP
luciferasa y su sustrato (luciferina)
pirosecuenciación*
el sistema de flujo hace pasar de manera secuencial cada uno de los cuatro nucleotidos (TACG) a traves de la:
placa q contiene pocillos
pirosecuenciación*
cada vez q en uno de los pocillos se incorpora un nucleotido se genera una señal…
quimioluminiscente q es recogida por una cámara digital
pirosecuenciación*
se analizan las imagenes obtenidas y se determina:
la secuencia del fragmento
*se reconstruye la secuencia del genoma original por métodos computacionales
ilumina. terminador reversible*
nucleotidos terminadores marcados bloqueados reversiblemente en el:
3´OH
ilumina. terminador reversible*
el bloqueo se retira _____________________ despues de haberse incorporado un nucleotido a la cadena (polimerización) y registrado la señal fluorescente q permite identificar q base fue
química o fotolíticamente
permite detectar con alta sensibilidad patrones de metilación aberrantes (cambios epigenéticos - DNA)
secuenciación por bisulfito
el tratamiento con bisulfito (previo a la secuenciación) convierte a la citosina en:
uracilo pero no afecta a la 5-metilcitosina
bisulfito*
falsos positivos
en el RNA y muestras con conversión incompleta
util en el analisis de muestras forenses, celulas madre, enfermedades como cancer
secuenciación por bisulfito
