Secuenciación masiva de genomas

Question 1

¿Qué es la secuenciación?

Answer 1

metodos bioquimicos para la determinacion de las BN en el ADN

metodologia

Question 2

Fundamento de Sanger (2)

Answer 2

• replicacion con polimerasa
• la adicion de ddNTPS (🚫 tienen OH para unirse con el fosfato en el 3’ de la ribosa) → detienen la unión

Cobertura y profundidad

Question 3

¿Cómo están marcados los ddNTPS en el fundamento de Sanger?

Answer 3

radioactivamente

Question 4

Método de secuenciación de Sanger (¿Qué se añadía? ¿Cómo se veía la secuenciación?)

Answer 4

• se añaden ddNTPS
• radioactividad
• visto por radiografia

ddNTPS: dideoxinucleotidos trifosfatados

Question 5

¿En qué año Sanger publicó su método?

Answer 5

1977

Question 6

¿En qué consistió la secuenciación de Sanger ddNTPS? (metodología)

Answer 6

• ADN molde monocatenario
• 4 rx. paralelas cada una con dNTPs (A, C, G, T) + pocos ddNTPs de uno de los análogos
• se incorporan en la nueva cadena (complementaria) de ADN por la pol
• si la pol agrega un “ddATP” cuando se una a su BN complementaria, al unirse la “T” terminan la cadena (porque no tiene OH para unión fosfodiéster)
• (ALEATORIAMENTE)

ddATP: nucleotidos terminadores marcados (más que ddNTPS)

Question 7

Método de Sanger

¿Cómo se separan al final los ADN?

Answer 7

por tamaño por electroforesis

Question 8

¿Qué extremo de la cadena tendrán todos los ADN al final del método de Sanger en común?

Answer 8

El extremo 5’, porque los extremos 3’ variarán dependiendo del ddNTP que se le una

Question 9

Composición de un ddNTP

Answer 9

carece de OH en el C 3’, en su lugar hay un H con colorante

Question 10

En la actualidad se usan ____ en vez de radioisótopos para marcar la radioactividad

Answer 10

fluorocromos

Question 11

¿Cómo se le llama a la secuenciación que utilizó Sanger?

Answer 11

tecnica de secuenciacion de primera generacion

Question 12

¿Qué es el next generation sequencing (NGS)?

segunda generacion

Answer 12

tecnica posterior a la de Sanger que permite secuenciar fragmentos de ADN en una sola reacción

Question 13

Tipos de de next generation sequencing (NGS)

todo lo que paso despues de Sanger

Answer 13

• secuenciacion de hibridacion
  → pirosecuenciacion SOLID (roche)
  → solexa (illumina)
  → PCR en emulsión Ion Torrent
• secuenciacion de 1 molecula en tiempo real

Question 14

¿Qué es la pirosecuenciacion SOLID (roche)?

Secuenciación de Detección por Ligación de Oligonucleótidos

Answer 14

Usa pirofosfato
1. Desnaturalización
2. Adición de adaptadores (oligo con tag de biotina)
3. Unión a perlas con streptavidina (microreactores)
4. Microreactor en emulsión se intruduce a pozo → contiene perlas con sulforilasa y luciferasa
5. Baño con dNTPs → unión de nt complementarios = liberación Ppi (genera luz y lo marca)

Si es color 🧡 → se marca el fluoroforo de 🧡 y → será visible

Se utiliza sonda de 8 nucleótidos

Question 15

¿Por quién son degradados los dNTPS que no se unen en la pirosecuenciacion?

Answer 15

apirasa

Question 16

¿Cómo el Ppi convierte a luz?

Answer 16

PPI → sulfurilasa → ATP → luciferasa → luz (visible) + oxoluciferina

PPI (sustrato para producir ATP)

Question 17

Fun fact

Answer 17

dNTP solo dan luz y no paran la secuenciación porque no es un ddNTP, los dNTP SÍ tienen OH

Question 18

Pasos de pirosecuenciacion

454

Answer 18

• se aisla ADN y se fragmenta
• se unen a oligonucleótidos (adaptadores)
• se separa en hebras simples
• fragmento de ADN se une a un micromolécula dentro de una emulsion
• emulsion tiene las cosas para hacer la duplicacion
• en los pozos se hace el proceso de pirofosfato para que las PB complementadas emitan luz

Lee las secuencias a la misma vez que se van creando

Question 19

¿Qué es el proceso de solexa (illumina)?

* illumina sequencing technology - video

Answer 19

1. ADN (📚) → traspasas a placa con forward y reverse oligos
2. unión hebra-oligos
3. ADN polimerasa ⚙️
4. ✂️ DNA de librería + se dobla la copia y alcanza oligo cont. (ADN polimerasa ⚙️) → amplificacion “en puente”
5. Reverse 🚫 → se adiciona el primer →
   mediante fluoróforos se detectan los NT durante la síntesis (first read)
6. Lectura de índices
7. Repetir (🚫 forward)
8. Clasificación mediante índices
9. Match forward y reverse con los mismos índices

Question 20

¿Qué es la PCR en emulsión Ion Torrent?

hibridacion

Answer 20

el marcaje (complementacion de PB) ya no produce luz como en a pirosecuenciacion sino que libera un H+

Question 21

Pasos de la PCR en emulsión Ion Torrent

Answer 21

• fragmentacion de ADN
• fragmentos se unen a diferentes partes de una micromolécula
• se lleva a un pozo, se llena con emulsion
• empieza complementacion
• PB “T” con “A” suelta un H+