PCR

Question 1

¿Qué es una PCR?

Answer 1

Técnica de amplificación in vitro de una molécula de ADNg

Question 2

La longitud del fragmento que se quiere replicar estará delimitado por…

Answer 2

Primers o cebadores u oligonucleótidos

Question 3

Tipos de PCR

Answer 3

• Convencional
• Cualitativo
• Semicuantitativo
• Cuantitativo
• Múltiple

Question 4

PCR convencional

Answer 4

• Amp. de una región genética específica
• Se usa gel de agarosa o acrilamida

Question 5

PCR cualitativo

Answer 5

Identifica presencia/ausencia de fragmento específico

Dx de enf. infecciosas

Question 6

PCR semicuantitativo

Answer 6

Permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm) (biopsias)

Question 7

PCR cuantitativo

Answer 7

Mide la cantidad de microorganismos o ARNm de un gen en particular

Question 8

PCR múltiple

Answer 8

Amp. de varias regiones genéticas en una misma reacción PCR

Cada region tiene 1 par de oligos

Question 9

Principio básico utilizado en la amplificación

Answer 9

Complementariedad

Dirección 5’ 3’ (3’ tiene que estar libre)

Question 10

3 etapas de la amplificación

Answer 10

• Desnaturalización
• Replicación
• Elongación

Question 11

Temperaturas de la amplificación (Paso 1)

Desnaturalización

Answer 11

95°C a 5 min

Question 12

Temperaturas de la amplificación (Paso 2)

Ciclos de amplificación (3)

Answer 12

• Desnaturalización (↑ 95°C a 30s)
• Alineamiento (50-60°C a 30-40s)
• Extensión (72°C)

Question 13

Temperaturas de la amplificación (Paso 3)

Amplificación final

Answer 13

72°C

Question 14

Temperaturas de la amplificación (Paso 4)

Almacenamiento temporal

Answer 14

4°C

Question 15

Componentes de la amplificación

Answer 15

• ADN
• Primers
• ADN polimerasa
• dNTPs (desoxinucleótidos)
• Magnesio (cofactor)

Polimerasa necesita de magnesio para funcionar

Question 16

Características de los dNTPs

Answer 16

Desoxinucleótidos libres en forma trifosfatada → forman enlace fosfodiéster

Question 17

PCR tiempo real

Fun fact

Answer 17

• Se observa la curva de amplificación
• El análisis permite identificar fluorescencia conforme avanza la reacción

Question 18

Métodos de detección de PCR en tiempo real

Answer 18

• Mediante fluorescencia
  → SYBR
  → TaqMan

Question 19

PCR en tiempo real

Características de SYBR

Answer 19

• Colorante fluorescente que se une al ADN de doble cadena.
• Mientras ↑ la amplificación del ADN durante la PCR, ↑ la fluorescencia

Question 20

PCR en tiempo real

Características de TaqMan

Answer 20

• Se utiliza para identificar SNPs
• Se utilizan sondas específicas marcadas con fluoróforos

Question 21

Pasos

TaqMan

Answer 21

• Metes la probe (Q y R)
• Pones primers
• La actividad exonucleasa de la Taq polimerasa degrada la sonda (R), separando fluoróforo del quencher → fluorescencia

Question 22

Pasos de la PCR tiempo real

Answer 22

• Amplificación
  → Desnaturalización
  → Alineamiento
  → Extensión

Question 23

Ventajas de la PCR tiempo real

Answer 23

• Posible calcular la eficiencia de la reacción
• Geles de agarosa no necesarios
• Hay + rapidez y eficiencia

Question 24

Aplicaciones de la PCR en tiempo real

Answer 24

• Análisis de expresión
• Investigación (polimorfismos en enf.)
• Dx de enfermedades