PCR

Question 1

¿Qué es una PCR?

Answer 1

Técnica de amplificación in vitro de una molécula de ADNg

Question 2

Principio básico utilizado en la amplificación

Answer 2

Complementariedad

Dirección 5’ 3’ (3’ tiene que estar libre)

Question 3

Temperaturas de la amplificación (Paso 1)

Desnaturalización

Answer 3

95°C a 5 min

Question 4

Temperaturas de la amplificación (Paso 2)

Ciclos de amplificación (3)

Answer 4

• Desnaturalización (↑ 95°C a 30s)
• Alineamiento (50-60°C a 30-40s)
• Extensión (72°C)

Question 5

Temperaturas de la amplificación (Paso 3)

Amplificación final

Answer 5

72°C

Question 6

Temperaturas de la amplificación (Paso 4)

Almacenamiento temporal

Answer 6

4°C

Question 7

Componentes de la amplificación

Answer 7

• ADN
• Primers
• ADN polimerasa
• dNTPs (desoxinucleótidos)
• Magnesio (cofactor)

Polimerasa necesita de magnesio para funcionar

Question 8

Características de los dNTPs

Answer 8

Desoxinucleótidos libres en forma trifosfatada → forman enlace fosfodiéster

Question 9

PCR tiempo real

Fun fact

Answer 9

• Se observa la curva de amplificación
• El análisis permite identificar fluorescencia conforme avanza la reacción

Question 10

Métodos de detección de PCR en tiempo real

Answer 10

• Mediante fluorescencia
  → SYBR
  → TaqMan

Question 11

PCR en tiempo real

Características de SYBR

Answer 11

• Colorante fluorescente que se une al dsDNA
• Mientras ↑ la amplificación del ADN durante la PCR, ↑ la fluorescencia

Question 12

¿Qué identifica SYBR?

Answer 12

Expresión del ADN

Question 13

¿Qué identifica TaqMan?

Answer 13

SNPs

Question 14

PCR en tiempo real

¿Qué se usa en TaqMan?

Answer 14

Sondas específicas marcadas con fluoróforos

Question 15

Pasos

TaqMan

Answer 15

• Metes la probe (Q y R)
• Pones primers
• Taq polimerasa

Question 16

TaqMan

La actividad exonucleasa de la ….. degrada la ….., separando ……. del ……. → fluorescencia

Answer 16

• Taq polimerasa
• Sonda (R)
• Fluoróforo
• Quencher

Question 17

Pasos de la PCR tiempo real

Answer 17

• Amplificación
  → Desnaturalización
  → Alineamiento
  → Extensión

Question 18

Ventajas de la PCR tiempo real

Answer 18

• Posible calcular la eficiencia de la reacción
• Geles de agarosa no necesarios
• Hay + rapidez y eficiencia

Question 19

Aplicaciones de la PCR en tiempo real

Answer 19

• Análisis de expresión
• Investigación (polimorfismos en enf)
• Dx de enfermedades (COVID)