Avaliação da Resposta Imune na Prática Clínica Flashcards

1
Q

O que é um imunoensaio?

A

Ensaio que deteta ou quantifica uma substância específica numa amostra biológica, usando o princípio da reação antigénio-anticorpo.

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2
Q

Qual é o objetivo do imunoensaio?

A

Estudar o sistema imune:
º Células do sistema imune;
º Proteínas do complemento;
º Avaliar resposta imune.

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3
Q

Como se avalia a resposta imune?

A

Através da presença de Acs:
º Acs contra Ags;
º IgEs (alergia);
º AutoAcs (doença autoimune).

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4
Q

O que são anticorpos policlonais?

A

Formação de clones de Acs para diferentes Ags.
Acs reconhecem diferentes epitopos no antigénio exposto.
São pouco úteis, por serem pouco específicos.

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5
Q

O que são anticorpos monoclonais?

A

Apenas 1 Ac para cada Ag.

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6
Q

Como se obtêm anticorpos monoclonais?

A

1º. Inoculação de um murganho com um determinado Ag.

2º. Retiram-se plasmócitos e faz-se a fusão destes com células do mieloma (confere IMORTALIDADE).

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7
Q

Qual a característica que permite que os imunocomplexos precipitem?

A

Elevado peso molecular.

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8
Q

Quais as técnicas baseadas em reacções de precipitação?

A
Dupla Difusão;
Imunodifusão radial (IDR);
Imunoeletroforese contracorrente;
Imunoeletroforese;
Imunoeletroforese rocket;
Imunofixação.
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9
Q

Em que consiste a imunodifusão radial (IDR)?

A

Técnica manual, que faz avaliação QUANTITATIVA dos anticorpos.
Avalia a presença de antigénios e a sua concentração.
1.- O antigénio é depositado nos poços de um gel que contém o anticorpo, e vai difundir em todas as direções.
2.- Na zona de equivalência Atg-Atc, o complexo imune precipita num anel concêntrico.
3.- Comparando com amostras de concentração conhecida é possível fazer uma avaliação quantitativa da concentração de Ag na amostra.
º Através da curva padrão, relaciona-se o tamanho dos halos de precipitação com a concentração de Ag.

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10
Q

Quais são as aplicações da IDR?

A

Quantificação de Igs, incluindo as subclasses de IgG.

Quantificação das proteínas do complemento e de outras proteínas séricas.

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11
Q

Quais as desvantagens da IDR?

A

Demora muito tempo, tem custos elevados.
Por causa disto, só é usada em ensaios onde não haja opção automática.
É usada em laboratório para quantificar proteínas que raramente são pedidas (C5-C9).

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12
Q

Como funcionam as reações de aglutinação?

A

São testes QUALITATIVOS.
Pressupõem a existência de Ags na superfície de eritrócitos e bactérias, que, se se ligarem a Acs, floculam ou aglutinam.
A aglutinação é visível a olho nu.
São testes rápidos, úteis em situações urgentes.

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13
Q

Quais são as moléculas envolvidas no processo de aglutinação?

A

Aglutininas - são anticorpos.
º IgM (pentamérica) - é aglutinina por excelência, por ter maior tamanho e maior capacidade de fixação do Ag.
º IgG - aglutinina pobre, exige condições ótimas de pH e temperatura para a reação.

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14
Q

Quais são as aplicações das reações de aglutinação?

A

Tipagem sanguínea (sistema AB0, sistema Rh).
Deteção de anticorpos antieritrocitários.
Identificação de agentes microbianos.
Deteção e titulação de anticorpos antiagente microbiano.

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15
Q

Métodos que avaliam a dispersão da luz

A

Automatizados.
- Avaliam interação entre imunocomplexo e radiação que o atravessa.
º Tamanho do imunocomplexo é ponto chave;
º Dispersão da luz será avaliada direta ou indiretamente.
Dois tipos:
a) Nefelometria - mede a intensidade da luz REFRATADA.
b) Turbidimetria - mede a intensidade da luz TRANSMITIDA.

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16
Q

Quais são as aplicações da nefelometria e da turbidimetria?

A
  • Doseamento de imunoglobulinas, respetivas cadeias leves e subclasses.
  • Doseamento de fatores do complemento (AH50, CH100).
  • Doseamento de proteínas de fase aguda:
    º PCR;
    º alfa-1-antitripsina;
    º ceruloplasmina;
    º haptoglobina;
    º fatores reumatoides;
    º TASO
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17
Q

Qual o objetivo dos métodos que utilizam marcadores/sondas?

A

Perceber se um determinado Ag/Ac está presente na amostra, utilizando depois um Ac com fluorocromo ou enzima que, ao ligar-se, causa mudança no meio.
Todos os ensaios de marcadores/sondas servem para RASTREIO.

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18
Q

Quais os diferentes métodos que utilizam marcadores/sondas?

A
  • Direto;
  • Indireto (+ utilizado);
  • Inibição ou Competitivo Indireto;
  • Competitivo (mede avidez da ligação);
  • Sandwich Simples;
  • Sandwich Dupla.
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19
Q

Em que consiste o EIA?

A

(Enzyme Immuno Assay)

  • Usa as propriedades catalíticas das enzimas.
  • Anticorpo com enzima = Ac-E
    1. - Ac-E liga-se a Ag.
    2. - Adiciona-se substrato da enzima.
    3. - Avalia-se:
    1. 1.- Diminuição do substrato;
    2. 2.- Aumento do produto de degradação.
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20
Q

Quais as enzimas utilizadas no EIA?

A

Fosfatase alcalina;
Peroxidase de rábano (HRP);
G6P desidrogenase;
Beta-galactosidase.

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21
Q

Qual a variante do EIA mais usada?

A

ELISA - Enzyme Lynked Immunosorbent Assay.

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22
Q

Quais as aplicações do EIA?

A

Doseamento de Igs, cadeias leves e subclasses;
Doseamento de avaliação funcional de fatores do complemento;
Monitorização de serologias infecciosas;
Monitorização de imunização;
Doseamento de marcadores tumorais;
Doseamento de hormonas.

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23
Q

Qual o teste usado para ensaios de avaliação de produção de citocinas e perforinas?

A

ELISpot.

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24
Q

Em que consiste o FEIA?

A

(Fluorescente Enzyme ImmunoAssay)

- Semelhante ao ELISA, mas com emissão de fluorescência.

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25
Quais são os quatro elementos do FEIA?
- Ag em fase sólida; - Ac da amostra; - Ac com enzima conjugada; - Substrato fluorogénico.
26
Quais as aplicações do Fluoro Immuno Assay (FIA)?
- FPIA: º Doseamento de hormonas tiroideias (T4); - FEIA: º Doseamento IgE total e IgEs específicas, IgGs e IgAs específicas; º Doseamento de proteína catiónica eosinofílica e triptase; º Anticorpos autoimunes; - ISAC: º Avaliação de IgEs específicas, IgAs e IgGs específicas.
27
Como se confirma uma infeção identificada em imuno ensaio de marcador/sonda?
Eletroforese em gel = Immuno Blot (Western Blot). | Permite confirmação diagnóstica após ELISA.
28
Em que consiste o Western Blot?
Deteta proteínas específicas. Implica: - Separação das proteínas num gel de policrilamida; - Transferência (blotting) das proteínas do gel para uma membrana estável; - Identificação da proteína com Ac específico. Permite detetar proteínas em misturas complexas, através da deteção da ligação do anticorpo: º Anticorpo marcado com radioisótopo ou complexo enzima-substrato.
29
Western Blot vs. ELISA
ELISA é mais sensível. Western Blot é mais específico - permite confirmar diagnóstico. Western Blot permite caraterizar algumas propriedades das proteínas, para além de fazer a sua quantificação.
30
Quais são as aplicações do Western Blot?
Ensaios confirmatórios: º Reações de hipersensibilidade mediadas por IgE; º Serologias infeciosas; º Autoanticorpos.
31
Quais os tipos de ensaios de imunofluorescência?
2 tipos: - Direta - Indireta
32
Imunofluorescência Direta
(Não se usa na Imunologia) => Usado principalmente na Anatomia Patológica. - Ac específico marcado com fluorocromo. - É aplicado diretamente sobre o corte de tecido onde se quer identificar o Ag. - Vê-se a amostra ao microscópio de fluorescência.
33
Imunofluorescência Indireta (IFI)
- Ac específico e um segundo Ac marcado com fluorocromo. - Coloca-se o soro do doente sobre um substrato adequado, que depende do Ac a pesquisar e da dispobilidade de Ag nos tecidos. - Adiciona-se antiglobulina humana (2º Ac), marcada com fluorescência.
34
Quais os fluorocromos mais utilizados?
FITC; PE; Rodamina B.
35
Quais as aplicações da IFI?
Deteção de autoanticorpos (screening de doenças autoimunes) - ANA, ANCA, ASMA, anti-TSH; Deteção de Acs contra agentes infeciosos;
36
Como se avaliam os fatores do complemento através do imunoensaio?
``` Doseamento: - Nefelometria / Turbidimetria (C3,C4); - ELISA; - IDR; Estudos Funcionais: - ELISA; - IDR. ```
37
Porque se usam eritrócitos para estudar os fatores do complemento?
Estuda-se a atividade hemolítica, porque esta é vísivel a olho nu.
38
Como se estudam as serologias infecciosas?
``` Serologias virais e doenças congénitas: - ELISA / EIA; - Quimioluminescência; - Imunfluorescência indireta (IFI); Ensaios confirmatórios: - Immunoblot; - Biologia molecular. ```
39
Como se distingue uma infeção antiga de uma 1ª infeção?
Infeção recente / aguda => IgM aumentado | Infeção antiga / crónica => IgG aumentado
40
Se estiver perante IgM e IgG aumentados, o que está a acontecer?
a) Seroconversão; | b) Reinfeção (há aumento de IgM por causa das células de memória).
41
Se tiver IgM e IgG aumentados, como distingo uma 1ª infeção de uma reinfeção?
Através da avidez da ligação: - Avidez maior = infeção antiga; - Avidez mais baixa = primeira infeção.
42
Que ensaios uso para identificar a presença de autoanticorpos?
``` Screening: - Imunofluorescência indireta (IFI); Ensaios confirmatórios: - Ensaios imunoenzimáticos; - Immunoblot; - Reações de precipitação; - Ensaios Multiplex. ```
43
Qual o substrato usado nos IFI para avaliar anticorpos antinucleares (ANA)?
Células Hep2.
44
Na IFI, o que devemos também avaliar, para além do estado geral da célula?
Mitoses.
45
A partir de que título se considera o IFI como teste positivo?
1/160.
46
Quais os quatro padrões existentes no IFI?
- Difuso / Homogéneo; - Mosqueado; - Centrómero; - Nucleolar.
47
Padrão Difuso ou Homogéneo
- Inespecífico; - 2º padrão mais comum; - Acs contra componentes dos cromossomas (dsDNA, histonas e nucleossomas); - Mitoses positivas; - Cromatina com coloração intensa, uniforme.
48
Quais as patologias associadas ao padrão difuso?
- Lúpus Eritematoso Sistémico (LES); | - Lúpus induzido por fármaco.
49
Padrão Mosqueado
- Inespecífico; - Padrão mais comum; - Acs contra ENAs (Ags nucleares extraíveis) [antiRNP, antiSm, antiSSA, antiSSB); - Mitoses negativas; - Cromatina sem coloração.
50
Quais as patologias associadas ao padrão mosqueado?
- LES (antiSm); - Mixed connective tissue disease (MCTD) [antiRNP]; - Síndrome de Sjorgen (antiSSA, antiSSB).
51
Padrão Centrómero
- Específico para CREST; - Acs dirigidos contra centrómeros; - Mitoses positivas; - Pequenos pontos fluorescentes no núcleo, agrupados ao longo do eixo mitótico.
52
Quais as patologias associadas ao padrão centrómero?
- CREST (calcinose, fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodermia, telangiectasias); - Cirrose biliar primária.
53
Padrão Nucleolar
- Relativamente específico para ES Difusa; - Acs dirigidos contra os nucléolos; - Pode surgir associado a outros padrões; - Mitoses: a cromatina pode aparecer negativa, positiva, ou com alguns pontilhados. - OBRIGATÓRIO pesquisar Scl-70 (Ac antiDNAtopoisomerase I) e Ac antifibrilarina (esclerose sistémica).
54
Quais as patologias associadas ao padrão nucleolar?
- Esclerodermia; - Doenças autoimunes reumáticas; - Miosite.
55
Como se avaliam as Igs e as proteínas de fase aguda?
``` Doseamento: - Nefelometria / turbidimetria; - ELISA; - IDR; - Eletroforese das proteínas séricas; Estudo da monoclonalidade das Igs: - Imunofixação; - Imunoeletroforese; - Eletroforese das proteínas séricas. ```
56
Pré-albumina
Sintetizada no fígado; Nem sempre aparece; Transporta hormonas tiroideias e derivados da vitamina A.
57
Quais as diferentes bandas de proteínas séricas?
``` (da esquerda para a direita): [Pré albumina]; Albumina; Alfa 1; Alfa 2; Beta; Gama. ```
58
Proteínas séricas
Macromoléculas, compostas por a.a. com ligações covalentes entre si.
59
De que depende a separação eletroforética?
pH do meio; | força iónica da solução tampão.
60
Níveis baixos de pré albumina sugerem...
Reações de fase aguda; Má nutrição proteica; Doença hepática.
61
Qual a proteína mais abundante do soro?
Albumina.
62
Onde é sintetizada a albumina?
No fígado.
63
Qual a função da albumina?
Transporta várias substâncias. | Mantém pressão oncótica.
64
O que sugere um aumento da albumina?
(Aumento é relativo, e raro) | - Desidratação.
65
O que sugere uma diminuição da albumina?
- Baixa produção hepática (má nutrição, doença hepática grave); - Aumenta da perda ou degradação (síndrome nefrótico - perda renal, queimadura - perda pela pele); - Inflamação crónica ou aguda; - Gravidez (aumenta volume sanguíneo); - Analbuminémia congénita.
66
Bisalbuminémia
Duplo pico de albumina; Pode ser congénita ou induzida por drogas; Associada a pancreatites agudas.
67
Qual a proteína que consitui cerca de 90% da região alfa 1?
Alfa 1 antitripsina.
68
Quais são as restantes proteínas da região alfa 1?
Thyroid binding globulin; Alfafetoproteína (AFP); Alfa 1 glicoproteína ácida; Alfa 1 lipoproteína (HDL).
69
Onde são sintetizadas as proteínas da região alfa 1?
Fígado.
70
A região alfa 1 engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?
Positivas.
71
O que leva a um aumento da região alfa 1?
``` Inflamação aguda e crónica; Neoplasia (ex: aumento de AFP = hepatocarcinoma); Pós trauma ou cirurgia; Gravidez; Estrogenoterapia. ```
72
O que leva a uma redução da região alfa 1?
Deficiência em alfa 1 antitripsina (enfisema, cirrose hepática); Doença hepática.
73
Quais as proteínas que fazem parte da região alfa 2?
Haptoglobina; Ceruloplasmina; Alfa 2 macroglobulina.
74
Onde são sintetizadas as proteínas da região alfa 2?
Fígado.
75
Qual(is) a(s) proteína(s) responsáveis pelo metabolismo do cobre?
Haptoglobina; | Ceruloplasmina.
76
Qual a proteína sérica de maior tamanho?
Alfa 2 macroglobulina.
77
A região alfa 2 engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?
Positivas.
78
O que leva a um aumento da região alfa 2?
- Proteínas de fase aguda ( ceruloplasmina e haptoglobina); | - Síndrome nefrótico (diminuição da albumina e aumento de alfa 2 macroglobulina).
79
O que leva a diminuição da região alfa 2?
``` Diminuição da ceruloplasmina: - Doença de Wilson - Má nutrição - Síndrome nefrótico - Enteropatia com perda de proteína Diminuição haptoglobina: - Hepatopatias graves - Anemia megaloblástica - Hemólise intravascular - Anemia hemolítica ```
80
O que são os anéis de Kayser-Fleischer?
Aparecem na doença de Wilson, à volta da íris, devido à deposição de cobre.
81
Quais as proteínas da região beta?
``` Beta1: - transferrina; - beta lipoproteínas; - outros fatores do complemento; Beta 2: - C3; IgA, IgM, IgG: também podem aparecer nesta região ```
82
A região beta engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?
Negativas.
83
O que leva a um aumento da região beta?
º Aumento da transferrina: anemia ferropénica, gravidez e estrogenoterapia; º Aumento das betalipoproteínas: hipercolesterolémia de tipo II, hipotiroidismo, cirrose biliar, síndrome nefrótico, alguns casos de DM; º Aumento de C3: inflamação, hipertensão maligna, doença de Cushing, carcinomas.
84
O que leva a diminuição da região beta?
º Diminuição da transferrina: inflamação aguda (diminui síntese hepática); º Diminuição C3: deficiências genéticas.
85
Quais as proteínas da região gama?
Igs: IgA, IgG, IgD, IgM e IgE. Maioritariamente constituída por IgG. PCR migra entre região beta e gama.
86
O que traduz um aumento da região gama?
``` Síndromes linfoproliferativos; Hiperimunização; Infeções agudas; Doença hepática crónica; Doença inflamatória crónica; Neoplasias disseminadas. ```
87
O que traduz uma diminuição da região gama?
Idade; Deficiência congénita ou adquirida; Tratamento imunosupressor (HIV, transplantação).
88
Quais os perfis existentes em eletroforese de proteínas séricas?
- Perfil normal; - Hipogamaglobulinémia /agamaglobulinémia; - Pico policlonal (com diminuição Alb = não muito grave); - Pico monoclonal (diminuição relativa Alb = neoplasia); - Reação de fase aguda (aumento alfa 1 e 2, diminuição Alb como compensação rápida); - Inflamação crónica (aumento gama, parece pico policlonal, mas Alb mantém-se =).
89
Imunoeletroforese
Praticamente substituída por imunofixação. | Feita no soro ou na urina.
90
Na imunofixação há controlo?
Não. Prescinde-se do controlo.
91
Quais as amostras possíveis para imunofixação?
Soro, urina, LCR.
92
Como se faz imunofixação?
1. Separação eletroforética da amostra; 2. Aplicação de tira de acetato de celulose com antisoro embebido; 3. Antisoro difunde-se no gel; 4. Complexos Ac-Ag precipitam; 5. Coloração dos complexos.
93
Que tipos de gamapatia existem?
Hipogamaglobulinémias: º Agamaglobulinémia (diminuição acentuada de todas as Igs); º Hipogamaglobulinémia (diminuição de todas as Igs); º Disgamaglobulinémia (deficiência seletiva). Hipergamaglobulinémias: º Monoclonal (elevação em pico, monoclonalidade da linhagem B, maligno); º Policlonal (elevação em barriga, estados cirróticos); º Oligoclonal.
94
Quais os testes laboratoriais ideias para identificações de hipogamaglobulinémia?
Doseamento das Igs; Eletroforese das proteínas; Imunofixação.
95
Nas hipergamaglobulinémias, é importante distinguir um pico monoclonal de um pico policlonal?
SIM. | Os picos monoclonais estão associados a processos clonais malignos (neoplasias).
96
Exemplos de gamapatias monoclonais
``` Mieloma múltiplo; Mieloma múltiplo assintomático; Plasmocitoma solitário; MGUS (pico monoclonal de origem indeterminada); Macroglobulinémia de Waldenstrom; Amiloidose; Doença de cadeias pesadas; Doenças linfoproliferativas B (linfomas, LLC). ```
97
Quais os testes laboratoriais usados para detetar gamapatias monoclonais?
``` Eletroforese de proteínas séricas; Imunofixação / Imunoeletroforese; Doseamento de Igs; Doseamento de cadeias leves integrais; Doseamento de cadeias leves livres séricas. ```
98
Doseamento de cadeias leves integrais
Determinado pela concentração de Igs intactas, normalmente IgA, IgG e IgM.
99
Aumento das cadeias leves integrais
Proliferação poli ou monoclonal. | Gamapatia monoclonal implica alteração da razão kappa:lambda.
100
Diminuição das cadeias leves integrais
Declínio de Igs intactas.
101
Doseamento de cadeias leves livres (CLLs)
CLLs são filtradas no glomérulo e reabsorvidas nos túbulos renais; CLLs kappa: monómeros, eliminadas 2-4 horas; CLLs lambda: dímeros, 3-6 horas.
102
Proteinúria de Bence Jones
Quando o aumento de CLLs excede a capacidade de reabsorção tubular, ou seja, há excreção de CLLs pela urina.
103
O soro contém mais CLL kappa ou lambda?
Mais CLL lambda, porque a filtração kappa é três vezes mais rápida que a filtração lambda.
104
Quantos sistemas tem a citometria de fluxo?
Três: - Sistema de fluidos; - Sistema óptico; - Sistema eletrónico.
105
Quais os parâmetros avaliados pela citometria de fluxo?
> Side scatter - 90º, complexidade e granularidade; | > Forward scatter - 180º, tamanho e superfície.
106
Quais os marcadores específicos das subpopulações linfocitárias?
``` Linf. T: CD3+ - T Helper: CD3+ CD4+; - T citotóxica: CD3+ CD8+; Linf. B: CD19+ Cél. NK: CD56+, CD16+, CD3- ```
107
A citometria de fluxo traduz-se graficamente em...
Dot plots.
108
Para que serve o valor absoluto da citometria de fluxo?
Prognóstico; | Terapêutica.
109
Quais as aplicações clínicas da citometria de fluxo das subpopulações linfocitárias?
- Estudo e caracterização de imunodeficiências; - VIH / SIDA; - Estudo e caracterização de doenças autoimunes; - Despiste de leucemias / linfomas.
110
Como é a razão CD4/CD8 normal?
O normal é ter mais CD4. | Uma inversão desta razão é sinal de patologia.
111
O que é avaliado num ensaio funcional?
``` Funções da resposta inata: - Fagocitose; - Metabolismo oxidativo; - Ativação de TLR; - Citotoxicidade NK; - Desgranulação de basófilos. Funções da resposta adaptativa: - Proliferação em resposta a estímulos; - Produção de citocinas; - Citotoxicidade T. ```
112
Como se faz um ensaio funcional da fagocitose?
Com E.coli opsonizada com Ig e complemento e marcadas com FITC.
113
Qual é o estímulo necessário para a ativação do burst oxidativo dos neutrófilos?
PMA.
114
Como se faz um ensaio funcional do metabolismo oxidativo?
1. - Dá-se PMA para estimular neutrófilos. 2. - Marca-se substrato DHR123 com corante encarnado. 3. - Se houver oxidação, DHR123 passa a R123 e fica verde.
115
Doença granulomatosa crónica
- 70% dos casos de défice no metabolismo oxidativo. - Défice de NADPH oxidase. - Ligada ao X. - Mais raro: autossómica recessiva.
116
Portadora sintomática
Menos sintomas, porque X normal compensa.
117
O que leva a diminuição da fagocitose?
``` Defeitos no neutrófilo; Alterações do complemento; Diminuição das Igs; Trauma; DM; Falha renal; SIDA. ```
118
O que leva a aumento da fagocitose?
Ação imunomoduladora: º IL-2; º Interferão gama; º Ácido lático.
119
O que leva a diminuição do metabolismo oxidativo?
- Doença granulomatosa crónica (NADPH oxidase); - Transplantação; - SIDA; - Idade.
120
Como se avalia a função linfocitária?
Isolamento de PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) por gradiente de densidade; Avaliação da proliferação celular (num citómetro de fluxo, com marcadores de proliferação).
121
O que são ensaios Multiplex?
Permitem avaliação e doseamento de citocinas e outras moléculas. Semelhante a 10 placas de ELISA num só teste, mas utiliza esferas para identificar moléculas.
122
Quais as amostras dos Multiplex?
Soro / plasma; Outros líquidos biológicos; Sobrenadantes de culturas celulares.
123
O que é a alossensibilização?
Existência de Acs contra Ags da própria espécie.
124
Quando pode ser feito o estudo da alossensibilização?
- PRA (panel reactive antibodies) pré transplantação; - Crossmatch na altura da transplantação; - PRA após transplantação ou estudo específico em crossmatch com células do dador previamente congeladas.
125
O que significa existirem anticorpos anti-HLA?
Rejeição de um transplante.
126
Entre 2 doentes, um mais alossensibilizado que outro, qual vamos escolher transplantar?
O mais alossensibilizado, porque tem menor probabilidade de voltar a encontrar compatibilidade.
127
Como se faz o estudo crossmatch dador - recetor?
- CDC; | - Citometria de fluxo.