Avaliação da Resposta Imune na Prática Clínica Flashcards
O que é um imunoensaio?
Ensaio que deteta ou quantifica uma substância específica numa amostra biológica, usando o princípio da reação antigénio-anticorpo.
Qual é o objetivo do imunoensaio?
Estudar o sistema imune:
º Células do sistema imune;
º Proteínas do complemento;
º Avaliar resposta imune.
Como se avalia a resposta imune?
Através da presença de Acs:
º Acs contra Ags;
º IgEs (alergia);
º AutoAcs (doença autoimune).
O que são anticorpos policlonais?
Formação de clones de Acs para diferentes Ags.
Acs reconhecem diferentes epitopos no antigénio exposto.
São pouco úteis, por serem pouco específicos.
O que são anticorpos monoclonais?
Apenas 1 Ac para cada Ag.
Como se obtêm anticorpos monoclonais?
1º. Inoculação de um murganho com um determinado Ag.
2º. Retiram-se plasmócitos e faz-se a fusão destes com células do mieloma (confere IMORTALIDADE).
Qual a característica que permite que os imunocomplexos precipitem?
Elevado peso molecular.
Quais as técnicas baseadas em reacções de precipitação?
Dupla Difusão; Imunodifusão radial (IDR); Imunoeletroforese contracorrente; Imunoeletroforese; Imunoeletroforese rocket; Imunofixação.
Em que consiste a imunodifusão radial (IDR)?
Técnica manual, que faz avaliação QUANTITATIVA dos anticorpos.
Avalia a presença de antigénios e a sua concentração.
1.- O antigénio é depositado nos poços de um gel que contém o anticorpo, e vai difundir em todas as direções.
2.- Na zona de equivalência Atg-Atc, o complexo imune precipita num anel concêntrico.
3.- Comparando com amostras de concentração conhecida é possível fazer uma avaliação quantitativa da concentração de Ag na amostra.
º Através da curva padrão, relaciona-se o tamanho dos halos de precipitação com a concentração de Ag.
Quais são as aplicações da IDR?
Quantificação de Igs, incluindo as subclasses de IgG.
Quantificação das proteínas do complemento e de outras proteínas séricas.
Quais as desvantagens da IDR?
Demora muito tempo, tem custos elevados.
Por causa disto, só é usada em ensaios onde não haja opção automática.
É usada em laboratório para quantificar proteínas que raramente são pedidas (C5-C9).
Como funcionam as reações de aglutinação?
São testes QUALITATIVOS.
Pressupõem a existência de Ags na superfície de eritrócitos e bactérias, que, se se ligarem a Acs, floculam ou aglutinam.
A aglutinação é visível a olho nu.
São testes rápidos, úteis em situações urgentes.
Quais são as moléculas envolvidas no processo de aglutinação?
Aglutininas - são anticorpos.
º IgM (pentamérica) - é aglutinina por excelência, por ter maior tamanho e maior capacidade de fixação do Ag.
º IgG - aglutinina pobre, exige condições ótimas de pH e temperatura para a reação.
Quais são as aplicações das reações de aglutinação?
Tipagem sanguínea (sistema AB0, sistema Rh).
Deteção de anticorpos antieritrocitários.
Identificação de agentes microbianos.
Deteção e titulação de anticorpos antiagente microbiano.
Métodos que avaliam a dispersão da luz
Automatizados.
- Avaliam interação entre imunocomplexo e radiação que o atravessa.
º Tamanho do imunocomplexo é ponto chave;
º Dispersão da luz será avaliada direta ou indiretamente.
Dois tipos:
a) Nefelometria - mede a intensidade da luz REFRATADA.
b) Turbidimetria - mede a intensidade da luz TRANSMITIDA.
Quais são as aplicações da nefelometria e da turbidimetria?
- Doseamento de imunoglobulinas, respetivas cadeias leves e subclasses.
- Doseamento de fatores do complemento (AH50, CH100).
- Doseamento de proteínas de fase aguda:
º PCR;
º alfa-1-antitripsina;
º ceruloplasmina;
º haptoglobina;
º fatores reumatoides;
º TASO
Qual o objetivo dos métodos que utilizam marcadores/sondas?
Perceber se um determinado Ag/Ac está presente na amostra, utilizando depois um Ac com fluorocromo ou enzima que, ao ligar-se, causa mudança no meio.
Todos os ensaios de marcadores/sondas servem para RASTREIO.
Quais os diferentes métodos que utilizam marcadores/sondas?
- Direto;
- Indireto (+ utilizado);
- Inibição ou Competitivo Indireto;
- Competitivo (mede avidez da ligação);
- Sandwich Simples;
- Sandwich Dupla.
Em que consiste o EIA?
(Enzyme Immuno Assay)
- Usa as propriedades catalíticas das enzimas.
- Anticorpo com enzima = Ac-E
1. - Ac-E liga-se a Ag.
2. - Adiciona-se substrato da enzima.
3. - Avalia-se:- 1.- Diminuição do substrato;
- 2.- Aumento do produto de degradação.
Quais as enzimas utilizadas no EIA?
Fosfatase alcalina;
Peroxidase de rábano (HRP);
G6P desidrogenase;
Beta-galactosidase.
Qual a variante do EIA mais usada?
ELISA - Enzyme Lynked Immunosorbent Assay.
Quais as aplicações do EIA?
Doseamento de Igs, cadeias leves e subclasses;
Doseamento de avaliação funcional de fatores do complemento;
Monitorização de serologias infecciosas;
Monitorização de imunização;
Doseamento de marcadores tumorais;
Doseamento de hormonas.
Qual o teste usado para ensaios de avaliação de produção de citocinas e perforinas?
ELISpot.
Em que consiste o FEIA?
(Fluorescente Enzyme ImmunoAssay)
- Semelhante ao ELISA, mas com emissão de fluorescência.
Quais são os quatro elementos do FEIA?
- Ag em fase sólida;
- Ac da amostra;
- Ac com enzima conjugada;
- Substrato fluorogénico.
Quais as aplicações do Fluoro Immuno Assay (FIA)?
- FPIA:
º Doseamento de hormonas tiroideias (T4); - FEIA:
º Doseamento IgE total e IgEs específicas, IgGs e IgAs específicas;
º Doseamento de proteína catiónica eosinofílica e triptase;
º Anticorpos autoimunes; - ISAC:
º Avaliação de IgEs específicas, IgAs e IgGs específicas.
Como se confirma uma infeção identificada em imuno ensaio de marcador/sonda?
Eletroforese em gel = Immuno Blot (Western Blot).
Permite confirmação diagnóstica após ELISA.
Em que consiste o Western Blot?
Deteta proteínas específicas.
Implica:
- Separação das proteínas num gel de policrilamida;
- Transferência (blotting) das proteínas do gel para uma membrana estável;
- Identificação da proteína com Ac específico.
Permite detetar proteínas em misturas complexas, através da deteção da ligação do anticorpo:
º Anticorpo marcado com radioisótopo ou complexo enzima-substrato.
Western Blot vs. ELISA
ELISA é mais sensível.
Western Blot é mais específico - permite confirmar diagnóstico.
Western Blot permite caraterizar algumas propriedades das proteínas, para além de fazer a sua quantificação.
Quais são as aplicações do Western Blot?
Ensaios confirmatórios:
º Reações de hipersensibilidade mediadas por IgE;
º Serologias infeciosas;
º Autoanticorpos.
Quais os tipos de ensaios de imunofluorescência?
2 tipos:
- Direta
- Indireta
Imunofluorescência Direta
(Não se usa na Imunologia) => Usado principalmente na Anatomia Patológica.
- Ac específico marcado com fluorocromo.
- É aplicado diretamente sobre o corte de tecido onde se quer identificar o Ag.
- Vê-se a amostra ao microscópio de fluorescência.
Imunofluorescência Indireta (IFI)
- Ac específico e um segundo Ac marcado com fluorocromo.
- Coloca-se o soro do doente sobre um substrato adequado, que depende do Ac a pesquisar e da dispobilidade de Ag nos tecidos.
- Adiciona-se antiglobulina humana (2º Ac), marcada com fluorescência.
Quais os fluorocromos mais utilizados?
FITC;
PE;
Rodamina B.
Quais as aplicações da IFI?
Deteção de autoanticorpos (screening de doenças autoimunes) - ANA, ANCA, ASMA, anti-TSH;
Deteção de Acs contra agentes infeciosos;
Como se avaliam os fatores do complemento através do imunoensaio?
Doseamento: - Nefelometria / Turbidimetria (C3,C4); - ELISA; - IDR; Estudos Funcionais: - ELISA; - IDR.
Porque se usam eritrócitos para estudar os fatores do complemento?
Estuda-se a atividade hemolítica, porque esta é vísivel a olho nu.
Como se estudam as serologias infecciosas?
Serologias virais e doenças congénitas: - ELISA / EIA; - Quimioluminescência; - Imunfluorescência indireta (IFI); Ensaios confirmatórios: - Immunoblot; - Biologia molecular.
Como se distingue uma infeção antiga de uma 1ª infeção?
Infeção recente / aguda => IgM aumentado
Infeção antiga / crónica => IgG aumentado
Se estiver perante IgM e IgG aumentados, o que está a acontecer?
a) Seroconversão;
b) Reinfeção (há aumento de IgM por causa das células de memória).
Se tiver IgM e IgG aumentados, como distingo uma 1ª infeção de uma reinfeção?
Através da avidez da ligação:
- Avidez maior = infeção antiga;
- Avidez mais baixa = primeira infeção.
Que ensaios uso para identificar a presença de autoanticorpos?
Screening: - Imunofluorescência indireta (IFI); Ensaios confirmatórios: - Ensaios imunoenzimáticos; - Immunoblot; - Reações de precipitação; - Ensaios Multiplex.
Qual o substrato usado nos IFI para avaliar anticorpos antinucleares (ANA)?
Células Hep2.
Na IFI, o que devemos também avaliar, para além do estado geral da célula?
Mitoses.
A partir de que título se considera o IFI como teste positivo?
1/160.
Quais os quatro padrões existentes no IFI?
- Difuso / Homogéneo;
- Mosqueado;
- Centrómero;
- Nucleolar.
Padrão Difuso ou Homogéneo
- Inespecífico;
- 2º padrão mais comum;
- Acs contra componentes dos cromossomas (dsDNA, histonas e nucleossomas);
- Mitoses positivas;
- Cromatina com coloração intensa, uniforme.
Quais as patologias associadas ao padrão difuso?
- Lúpus Eritematoso Sistémico (LES);
- Lúpus induzido por fármaco.
Padrão Mosqueado
- Inespecífico;
- Padrão mais comum;
- Acs contra ENAs (Ags nucleares extraíveis) [antiRNP, antiSm, antiSSA, antiSSB);
- Mitoses negativas;
- Cromatina sem coloração.
Quais as patologias associadas ao padrão mosqueado?
- LES (antiSm);
- Mixed connective tissue disease (MCTD) [antiRNP];
- Síndrome de Sjorgen (antiSSA, antiSSB).
Padrão Centrómero
- Específico para CREST;
- Acs dirigidos contra centrómeros;
- Mitoses positivas;
- Pequenos pontos fluorescentes no núcleo, agrupados ao longo do eixo mitótico.
Quais as patologias associadas ao padrão centrómero?
- CREST (calcinose, fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodermia, telangiectasias);
- Cirrose biliar primária.
Padrão Nucleolar
- Relativamente específico para ES Difusa;
- Acs dirigidos contra os nucléolos;
- Pode surgir associado a outros padrões;
- Mitoses: a cromatina pode aparecer negativa, positiva, ou com alguns pontilhados.
- OBRIGATÓRIO pesquisar Scl-70 (Ac antiDNAtopoisomerase I) e Ac antifibrilarina (esclerose sistémica).
Quais as patologias associadas ao padrão nucleolar?
- Esclerodermia;
- Doenças autoimunes reumáticas;
- Miosite.
Como se avaliam as Igs e as proteínas de fase aguda?
Doseamento: - Nefelometria / turbidimetria; - ELISA; - IDR; - Eletroforese das proteínas séricas; Estudo da monoclonalidade das Igs: - Imunofixação; - Imunoeletroforese; - Eletroforese das proteínas séricas.
Pré-albumina
Sintetizada no fígado;
Nem sempre aparece;
Transporta hormonas tiroideias e derivados da vitamina A.
Quais as diferentes bandas de proteínas séricas?
(da esquerda para a direita): [Pré albumina]; Albumina; Alfa 1; Alfa 2; Beta; Gama.
Proteínas séricas
Macromoléculas, compostas por a.a. com ligações covalentes entre si.
De que depende a separação eletroforética?
pH do meio;
força iónica da solução tampão.
Níveis baixos de pré albumina sugerem…
Reações de fase aguda;
Má nutrição proteica;
Doença hepática.
Qual a proteína mais abundante do soro?
Albumina.
Onde é sintetizada a albumina?
No fígado.
Qual a função da albumina?
Transporta várias substâncias.
Mantém pressão oncótica.
O que sugere um aumento da albumina?
(Aumento é relativo, e raro)
- Desidratação.
O que sugere uma diminuição da albumina?
- Baixa produção hepática (má nutrição, doença hepática grave);
- Aumenta da perda ou degradação (síndrome nefrótico - perda renal, queimadura - perda pela pele);
- Inflamação crónica ou aguda;
- Gravidez (aumenta volume sanguíneo);
- Analbuminémia congénita.
Bisalbuminémia
Duplo pico de albumina;
Pode ser congénita ou induzida por drogas;
Associada a pancreatites agudas.
Qual a proteína que consitui cerca de 90% da região alfa 1?
Alfa 1 antitripsina.
Quais são as restantes proteínas da região alfa 1?
Thyroid binding globulin;
Alfafetoproteína (AFP);
Alfa 1 glicoproteína ácida;
Alfa 1 lipoproteína (HDL).
Onde são sintetizadas as proteínas da região alfa 1?
Fígado.
A região alfa 1 engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?
Positivas.
O que leva a um aumento da região alfa 1?
Inflamação aguda e crónica; Neoplasia (ex: aumento de AFP = hepatocarcinoma); Pós trauma ou cirurgia; Gravidez; Estrogenoterapia.
O que leva a uma redução da região alfa 1?
Deficiência em alfa 1 antitripsina (enfisema, cirrose hepática);
Doença hepática.
Quais as proteínas que fazem parte da região alfa 2?
Haptoglobina;
Ceruloplasmina;
Alfa 2 macroglobulina.
Onde são sintetizadas as proteínas da região alfa 2?
Fígado.
Qual(is) a(s) proteína(s) responsáveis pelo metabolismo do cobre?
Haptoglobina;
Ceruloplasmina.
Qual a proteína sérica de maior tamanho?
Alfa 2 macroglobulina.
A região alfa 2 engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?
Positivas.
O que leva a um aumento da região alfa 2?
- Proteínas de fase aguda ( ceruloplasmina e haptoglobina);
- Síndrome nefrótico (diminuição da albumina e aumento de alfa 2 macroglobulina).
O que leva a diminuição da região alfa 2?
Diminuição da ceruloplasmina: - Doença de Wilson - Má nutrição - Síndrome nefrótico - Enteropatia com perda de proteína Diminuição haptoglobina: - Hepatopatias graves - Anemia megaloblástica - Hemólise intravascular - Anemia hemolítica
O que são os anéis de Kayser-Fleischer?
Aparecem na doença de Wilson, à volta da íris, devido à deposição de cobre.
Quais as proteínas da região beta?
Beta1: - transferrina; - beta lipoproteínas; - outros fatores do complemento; Beta 2: - C3; IgA, IgM, IgG: também podem aparecer nesta região
A região beta engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?
Negativas.
O que leva a um aumento da região beta?
º Aumento da transferrina: anemia ferropénica, gravidez e estrogenoterapia;
º Aumento das betalipoproteínas: hipercolesterolémia de tipo II, hipotiroidismo, cirrose biliar, síndrome nefrótico, alguns casos de DM;
º Aumento de C3: inflamação, hipertensão maligna, doença de Cushing, carcinomas.
O que leva a diminuição da região beta?
º Diminuição da transferrina: inflamação aguda (diminui síntese hepática);
º Diminuição C3: deficiências genéticas.
Quais as proteínas da região gama?
Igs: IgA, IgG, IgD, IgM e IgE.
Maioritariamente constituída por IgG.
PCR migra entre região beta e gama.
O que traduz um aumento da região gama?
Síndromes linfoproliferativos; Hiperimunização; Infeções agudas; Doença hepática crónica; Doença inflamatória crónica; Neoplasias disseminadas.
O que traduz uma diminuição da região gama?
Idade;
Deficiência congénita ou adquirida;
Tratamento imunosupressor (HIV, transplantação).
Quais os perfis existentes em eletroforese de proteínas séricas?
- Perfil normal;
- Hipogamaglobulinémia /agamaglobulinémia;
- Pico policlonal (com diminuição Alb = não muito grave);
- Pico monoclonal (diminuição relativa Alb = neoplasia);
- Reação de fase aguda (aumento alfa 1 e 2, diminuição Alb como compensação rápida);
- Inflamação crónica (aumento gama, parece pico policlonal, mas Alb mantém-se =).
Imunoeletroforese
Praticamente substituída por imunofixação.
Feita no soro ou na urina.
Na imunofixação há controlo?
Não. Prescinde-se do controlo.
Quais as amostras possíveis para imunofixação?
Soro, urina, LCR.
Como se faz imunofixação?
- Separação eletroforética da amostra;
- Aplicação de tira de acetato de celulose com antisoro embebido;
- Antisoro difunde-se no gel;
- Complexos Ac-Ag precipitam;
- Coloração dos complexos.
Que tipos de gamapatia existem?
Hipogamaglobulinémias:
º Agamaglobulinémia (diminuição acentuada de todas as Igs);
º Hipogamaglobulinémia (diminuição de todas as Igs);
º Disgamaglobulinémia (deficiência seletiva).
Hipergamaglobulinémias:
º Monoclonal (elevação em pico, monoclonalidade da linhagem B, maligno);
º Policlonal (elevação em barriga, estados cirróticos);
º Oligoclonal.
Quais os testes laboratoriais ideias para identificações de hipogamaglobulinémia?
Doseamento das Igs;
Eletroforese das proteínas;
Imunofixação.
Nas hipergamaglobulinémias, é importante distinguir um pico monoclonal de um pico policlonal?
SIM.
Os picos monoclonais estão associados a processos clonais malignos (neoplasias).
Exemplos de gamapatias monoclonais
Mieloma múltiplo; Mieloma múltiplo assintomático; Plasmocitoma solitário; MGUS (pico monoclonal de origem indeterminada); Macroglobulinémia de Waldenstrom; Amiloidose; Doença de cadeias pesadas; Doenças linfoproliferativas B (linfomas, LLC).
Quais os testes laboratoriais usados para detetar gamapatias monoclonais?
Eletroforese de proteínas séricas; Imunofixação / Imunoeletroforese; Doseamento de Igs; Doseamento de cadeias leves integrais; Doseamento de cadeias leves livres séricas.
Doseamento de cadeias leves integrais
Determinado pela concentração de Igs intactas, normalmente IgA, IgG e IgM.
Aumento das cadeias leves integrais
Proliferação poli ou monoclonal.
Gamapatia monoclonal implica alteração da razão kappa:lambda.
Diminuição das cadeias leves integrais
Declínio de Igs intactas.
Doseamento de cadeias leves livres (CLLs)
CLLs são filtradas no glomérulo e reabsorvidas nos túbulos renais;
CLLs kappa: monómeros, eliminadas 2-4 horas;
CLLs lambda: dímeros, 3-6 horas.
Proteinúria de Bence Jones
Quando o aumento de CLLs excede a capacidade de reabsorção tubular, ou seja, há excreção de CLLs pela urina.
O soro contém mais CLL kappa ou lambda?
Mais CLL lambda, porque a filtração kappa é três vezes mais rápida que a filtração lambda.
Quantos sistemas tem a citometria de fluxo?
Três:
- Sistema de fluidos;
- Sistema óptico;
- Sistema eletrónico.
Quais os parâmetros avaliados pela citometria de fluxo?
> Side scatter - 90º, complexidade e granularidade;
> Forward scatter - 180º, tamanho e superfície.
Quais os marcadores específicos das subpopulações linfocitárias?
Linf. T: CD3+ - T Helper: CD3+ CD4+; - T citotóxica: CD3+ CD8+; Linf. B: CD19+ Cél. NK: CD56+, CD16+, CD3-
A citometria de fluxo traduz-se graficamente em…
Dot plots.
Para que serve o valor absoluto da citometria de fluxo?
Prognóstico;
Terapêutica.
Quais as aplicações clínicas da citometria de fluxo das subpopulações linfocitárias?
- Estudo e caracterização de imunodeficiências;
- VIH / SIDA;
- Estudo e caracterização de doenças autoimunes;
- Despiste de leucemias / linfomas.
Como é a razão CD4/CD8 normal?
O normal é ter mais CD4.
Uma inversão desta razão é sinal de patologia.
O que é avaliado num ensaio funcional?
Funções da resposta inata: - Fagocitose; - Metabolismo oxidativo; - Ativação de TLR; - Citotoxicidade NK; - Desgranulação de basófilos. Funções da resposta adaptativa: - Proliferação em resposta a estímulos; - Produção de citocinas; - Citotoxicidade T.
Como se faz um ensaio funcional da fagocitose?
Com E.coli opsonizada com Ig e complemento e marcadas com FITC.
Qual é o estímulo necessário para a ativação do burst oxidativo dos neutrófilos?
PMA.
Como se faz um ensaio funcional do metabolismo oxidativo?
- Dá-se PMA para estimular neutrófilos.
- Marca-se substrato DHR123 com corante encarnado.
- Se houver oxidação, DHR123 passa a R123 e fica verde.
Doença granulomatosa crónica
- 70% dos casos de défice no metabolismo oxidativo.
- Défice de NADPH oxidase.
- Ligada ao X.
- Mais raro: autossómica recessiva.
Portadora sintomática
Menos sintomas, porque X normal compensa.
O que leva a diminuição da fagocitose?
Defeitos no neutrófilo; Alterações do complemento; Diminuição das Igs; Trauma; DM; Falha renal; SIDA.
O que leva a aumento da fagocitose?
Ação imunomoduladora:
º IL-2;
º Interferão gama;
º Ácido lático.
O que leva a diminuição do metabolismo oxidativo?
- Doença granulomatosa crónica (NADPH oxidase);
- Transplantação;
- SIDA;
- Idade.
Como se avalia a função linfocitária?
Isolamento de PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) por gradiente de densidade;
Avaliação da proliferação celular (num citómetro de fluxo, com marcadores de proliferação).
O que são ensaios Multiplex?
Permitem avaliação e doseamento de citocinas e outras moléculas.
Semelhante a 10 placas de ELISA num só teste, mas utiliza esferas para identificar moléculas.
Quais as amostras dos Multiplex?
Soro / plasma;
Outros líquidos biológicos;
Sobrenadantes de culturas celulares.
O que é a alossensibilização?
Existência de Acs contra Ags da própria espécie.
Quando pode ser feito o estudo da alossensibilização?
- PRA (panel reactive antibodies) pré transplantação;
- Crossmatch na altura da transplantação;
- PRA após transplantação ou estudo específico em crossmatch com células do dador previamente congeladas.
O que significa existirem anticorpos anti-HLA?
Rejeição de um transplante.
Entre 2 doentes, um mais alossensibilizado que outro, qual vamos escolher transplantar?
O mais alossensibilizado, porque tem menor probabilidade de voltar a encontrar compatibilidade.
Como se faz o estudo crossmatch dador - recetor?
- CDC;
- Citometria de fluxo.
