Avaliação da Resposta Imune na Prática Clínica Flashcards
O que é um imunoensaio?
Ensaio que deteta ou quantifica uma substância específica numa amostra biológica, usando o princípio da reação antigénio-anticorpo.
Qual é o objetivo do imunoensaio?
Estudar o sistema imune:
º Células do sistema imune;
º Proteínas do complemento;
º Avaliar resposta imune.
Como se avalia a resposta imune?
Através da presença de Acs:
º Acs contra Ags;
º IgEs (alergia);
º AutoAcs (doença autoimune).
O que são anticorpos policlonais?
Formação de clones de Acs para diferentes Ags.
Acs reconhecem diferentes epitopos no antigénio exposto.
São pouco úteis, por serem pouco específicos.
O que são anticorpos monoclonais?
Apenas 1 Ac para cada Ag.
Como se obtêm anticorpos monoclonais?
1º. Inoculação de um murganho com um determinado Ag.
2º. Retiram-se plasmócitos e faz-se a fusão destes com células do mieloma (confere IMORTALIDADE).
Qual a característica que permite que os imunocomplexos precipitem?
Elevado peso molecular.
Quais as técnicas baseadas em reacções de precipitação?
Dupla Difusão; Imunodifusão radial (IDR); Imunoeletroforese contracorrente; Imunoeletroforese; Imunoeletroforese rocket; Imunofixação.
Em que consiste a imunodifusão radial (IDR)?
Técnica manual, que faz avaliação QUANTITATIVA dos anticorpos.
Avalia a presença de antigénios e a sua concentração.
1.- O antigénio é depositado nos poços de um gel que contém o anticorpo, e vai difundir em todas as direções.
2.- Na zona de equivalência Atg-Atc, o complexo imune precipita num anel concêntrico.
3.- Comparando com amostras de concentração conhecida é possível fazer uma avaliação quantitativa da concentração de Ag na amostra.
º Através da curva padrão, relaciona-se o tamanho dos halos de precipitação com a concentração de Ag.
Quais são as aplicações da IDR?
Quantificação de Igs, incluindo as subclasses de IgG.
Quantificação das proteínas do complemento e de outras proteínas séricas.
Quais as desvantagens da IDR?
Demora muito tempo, tem custos elevados.
Por causa disto, só é usada em ensaios onde não haja opção automática.
É usada em laboratório para quantificar proteínas que raramente são pedidas (C5-C9).
Como funcionam as reações de aglutinação?
São testes QUALITATIVOS.
Pressupõem a existência de Ags na superfície de eritrócitos e bactérias, que, se se ligarem a Acs, floculam ou aglutinam.
A aglutinação é visível a olho nu.
São testes rápidos, úteis em situações urgentes.
Quais são as moléculas envolvidas no processo de aglutinação?
Aglutininas - são anticorpos.
º IgM (pentamérica) - é aglutinina por excelência, por ter maior tamanho e maior capacidade de fixação do Ag.
º IgG - aglutinina pobre, exige condições ótimas de pH e temperatura para a reação.
Quais são as aplicações das reações de aglutinação?
Tipagem sanguínea (sistema AB0, sistema Rh).
Deteção de anticorpos antieritrocitários.
Identificação de agentes microbianos.
Deteção e titulação de anticorpos antiagente microbiano.
Métodos que avaliam a dispersão da luz
Automatizados.
- Avaliam interação entre imunocomplexo e radiação que o atravessa.
º Tamanho do imunocomplexo é ponto chave;
º Dispersão da luz será avaliada direta ou indiretamente.
Dois tipos:
a) Nefelometria - mede a intensidade da luz REFRATADA.
b) Turbidimetria - mede a intensidade da luz TRANSMITIDA.
Quais são as aplicações da nefelometria e da turbidimetria?
- Doseamento de imunoglobulinas, respetivas cadeias leves e subclasses.
- Doseamento de fatores do complemento (AH50, CH100).
- Doseamento de proteínas de fase aguda:
º PCR;
º alfa-1-antitripsina;
º ceruloplasmina;
º haptoglobina;
º fatores reumatoides;
º TASO
Qual o objetivo dos métodos que utilizam marcadores/sondas?
Perceber se um determinado Ag/Ac está presente na amostra, utilizando depois um Ac com fluorocromo ou enzima que, ao ligar-se, causa mudança no meio.
Todos os ensaios de marcadores/sondas servem para RASTREIO.
Quais os diferentes métodos que utilizam marcadores/sondas?
- Direto;
- Indireto (+ utilizado);
- Inibição ou Competitivo Indireto;
- Competitivo (mede avidez da ligação);
- Sandwich Simples;
- Sandwich Dupla.
Em que consiste o EIA?
(Enzyme Immuno Assay)
- Usa as propriedades catalíticas das enzimas.
- Anticorpo com enzima = Ac-E
1. - Ac-E liga-se a Ag.
2. - Adiciona-se substrato da enzima.
3. - Avalia-se:- 1.- Diminuição do substrato;
- 2.- Aumento do produto de degradação.
Quais as enzimas utilizadas no EIA?
Fosfatase alcalina;
Peroxidase de rábano (HRP);
G6P desidrogenase;
Beta-galactosidase.
Qual a variante do EIA mais usada?
ELISA - Enzyme Lynked Immunosorbent Assay.
Quais as aplicações do EIA?
Doseamento de Igs, cadeias leves e subclasses;
Doseamento de avaliação funcional de fatores do complemento;
Monitorização de serologias infecciosas;
Monitorização de imunização;
Doseamento de marcadores tumorais;
Doseamento de hormonas.
Qual o teste usado para ensaios de avaliação de produção de citocinas e perforinas?
ELISpot.
Em que consiste o FEIA?
(Fluorescente Enzyme ImmunoAssay)
- Semelhante ao ELISA, mas com emissão de fluorescência.
Quais são os quatro elementos do FEIA?
- Ag em fase sólida;
- Ac da amostra;
- Ac com enzima conjugada;
- Substrato fluorogénico.
Quais as aplicações do Fluoro Immuno Assay (FIA)?
- FPIA:
º Doseamento de hormonas tiroideias (T4); - FEIA:
º Doseamento IgE total e IgEs específicas, IgGs e IgAs específicas;
º Doseamento de proteína catiónica eosinofílica e triptase;
º Anticorpos autoimunes; - ISAC:
º Avaliação de IgEs específicas, IgAs e IgGs específicas.
Como se confirma uma infeção identificada em imuno ensaio de marcador/sonda?
Eletroforese em gel = Immuno Blot (Western Blot).
Permite confirmação diagnóstica após ELISA.
Em que consiste o Western Blot?
Deteta proteínas específicas.
Implica:
- Separação das proteínas num gel de policrilamida;
- Transferência (blotting) das proteínas do gel para uma membrana estável;
- Identificação da proteína com Ac específico.
Permite detetar proteínas em misturas complexas, através da deteção da ligação do anticorpo:
º Anticorpo marcado com radioisótopo ou complexo enzima-substrato.
Western Blot vs. ELISA
ELISA é mais sensível.
Western Blot é mais específico - permite confirmar diagnóstico.
Western Blot permite caraterizar algumas propriedades das proteínas, para além de fazer a sua quantificação.
Quais são as aplicações do Western Blot?
Ensaios confirmatórios:
º Reações de hipersensibilidade mediadas por IgE;
º Serologias infeciosas;
º Autoanticorpos.
Quais os tipos de ensaios de imunofluorescência?
2 tipos:
- Direta
- Indireta
Imunofluorescência Direta
(Não se usa na Imunologia) => Usado principalmente na Anatomia Patológica.
- Ac específico marcado com fluorocromo.
- É aplicado diretamente sobre o corte de tecido onde se quer identificar o Ag.
- Vê-se a amostra ao microscópio de fluorescência.
Imunofluorescência Indireta (IFI)
- Ac específico e um segundo Ac marcado com fluorocromo.
- Coloca-se o soro do doente sobre um substrato adequado, que depende do Ac a pesquisar e da dispobilidade de Ag nos tecidos.
- Adiciona-se antiglobulina humana (2º Ac), marcada com fluorescência.
Quais os fluorocromos mais utilizados?
FITC;
PE;
Rodamina B.
Quais as aplicações da IFI?
Deteção de autoanticorpos (screening de doenças autoimunes) - ANA, ANCA, ASMA, anti-TSH;
Deteção de Acs contra agentes infeciosos;
Como se avaliam os fatores do complemento através do imunoensaio?
Doseamento: - Nefelometria / Turbidimetria (C3,C4); - ELISA; - IDR; Estudos Funcionais: - ELISA; - IDR.
Porque se usam eritrócitos para estudar os fatores do complemento?
Estuda-se a atividade hemolítica, porque esta é vísivel a olho nu.
Como se estudam as serologias infecciosas?
Serologias virais e doenças congénitas: - ELISA / EIA; - Quimioluminescência; - Imunfluorescência indireta (IFI); Ensaios confirmatórios: - Immunoblot; - Biologia molecular.
Como se distingue uma infeção antiga de uma 1ª infeção?
Infeção recente / aguda => IgM aumentado
Infeção antiga / crónica => IgG aumentado
Se estiver perante IgM e IgG aumentados, o que está a acontecer?
a) Seroconversão;
b) Reinfeção (há aumento de IgM por causa das células de memória).
Se tiver IgM e IgG aumentados, como distingo uma 1ª infeção de uma reinfeção?
Através da avidez da ligação:
- Avidez maior = infeção antiga;
- Avidez mais baixa = primeira infeção.
Que ensaios uso para identificar a presença de autoanticorpos?
Screening: - Imunofluorescência indireta (IFI); Ensaios confirmatórios: - Ensaios imunoenzimáticos; - Immunoblot; - Reações de precipitação; - Ensaios Multiplex.
Qual o substrato usado nos IFI para avaliar anticorpos antinucleares (ANA)?
Células Hep2.
Na IFI, o que devemos também avaliar, para além do estado geral da célula?
Mitoses.
A partir de que título se considera o IFI como teste positivo?
1/160.
Quais os quatro padrões existentes no IFI?
- Difuso / Homogéneo;
- Mosqueado;
- Centrómero;
- Nucleolar.
Padrão Difuso ou Homogéneo
- Inespecífico;
- 2º padrão mais comum;
- Acs contra componentes dos cromossomas (dsDNA, histonas e nucleossomas);
- Mitoses positivas;
- Cromatina com coloração intensa, uniforme.
Quais as patologias associadas ao padrão difuso?
- Lúpus Eritematoso Sistémico (LES);
- Lúpus induzido por fármaco.
Padrão Mosqueado
- Inespecífico;
- Padrão mais comum;
- Acs contra ENAs (Ags nucleares extraíveis) [antiRNP, antiSm, antiSSA, antiSSB);
- Mitoses negativas;
- Cromatina sem coloração.
Quais as patologias associadas ao padrão mosqueado?
- LES (antiSm);
- Mixed connective tissue disease (MCTD) [antiRNP];
- Síndrome de Sjorgen (antiSSA, antiSSB).