Secuenciación masiva de genomas Flashcards

1
Q

¿Qué es la secuenciación?

A

Metodología basada en métodos bioquímicos para determinar el orden del código genético

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2
Q

¿Cuándo se creo el método del secuenciación de Sanger?

A

1977

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3
Q

Fundamento del método de secuenciación de Sanger

A
  • Basado en la replicación de la molécula de ADN con ayuda de la ADN polimerasa.
  • Adición de dideoxinucleótido no cuentan con el OH en 3´de la ribosa → terminadores
  • Provoca la terminación de la cadena de manera aleatoria
  • Cada uno de estos ddNTPs están maracdos (al inicio radiactivamente)
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4
Q

Metodología de la secuenciación de Sanger

A

Contenido de cada tubo → Cadena de DNA sencilla, Dntps, DNA polimerasa, Ddntp específico (A, G, T o C), primers y MgCl2.
* Al unirse el ddntp se corta la cadena.
* Permite saber el posicionamiento de cada nucleótido en el DNA.
* Se puede leer fragamentos de 50-300 nucleótidos

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5
Q

Ddntp

A
  • Sin OH en 3´.
  • No permite unión a otro nucleótido.
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6
Q

Secuenciación automatizada

A
  • Secuenciación de Sanger modificada.
  • En un solo tubo.
  • Cada ddntp esta marcado con un florocromo.
  • Se separan las cadenas por talla mediante electroforesis capilar.
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7
Q

Next generation sequencing

A
  • Permiten secuenciar de manera masiva y paralela distintos fragmentos de DNA.

Secuenciación por hibridación → 454 Pirosecuenciación SOLID (Roche), Solexa (Ilumina)
Secuenciación de una sola molécula en tiempo real → SMRT

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8
Q

Pirosecuenciación

A
  • No utliza gel de acrilamida
  • Secuencia fragmentos de 200-400 pbs
  • Liberación de pirofosfáto → unión de nucleótido a DNA
  • dntps no usados son degradados por apirasa
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9
Q

Illumina (SOLEXA)

A
  • Amplificación en puente o cluster de PCR
  • Se cuenta con fragmentos de DNA adheridos a una célula de flujo.
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10
Q

PCR en emulsión Ion Torrent

A
  • Fragmentación → transposon corta y coloca adaptador
  • Unión y replicación en bead (perla emulsificadora + PCR)
  • Deposito de cada bead en un pozo del Ion chip
  • Cada pozo es llenado con dntps específicos, cuando hay unión se libera H+ y se registra el cambio de pH por voltaje.
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11
Q

Beneficios del NGS

A
  • Permite la secuenciación de múltiples sitios a escala masiva
  • Millones a billones de fragmentos de DNA secuenciados en una sola reacción.
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12
Q

Cobertura

A

Promedio de número de lecturas que se alinean en una secuencia de referencia.
Cuantas veces estoy evaluando un fragmento, que tanta certeza tengo, a mayor numero de repetición, mayor precisión.

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13
Q

Profundidad

A

Número de veces que ha sido secuenciada una base del genoma

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