Secuenciación masiva de genomas Flashcards
¿Qué es la secuenciación?
Metodología basada en métodos bioquímicos para determinar el orden del código genético
¿Cuándo se creo el método del secuenciación de Sanger?
1977
Fundamento del método de secuenciación de Sanger
- Basado en la replicación de la molécula de ADN con ayuda de la ADN polimerasa.
- Adición de dideoxinucleótido no cuentan con el OH en 3´de la ribosa → terminadores
- Provoca la terminación de la cadena de manera aleatoria
- Cada uno de estos ddNTPs están maracdos (al inicio radiactivamente)
Metodología de la secuenciación de Sanger
Contenido de cada tubo → Cadena de DNA sencilla, Dntps, DNA polimerasa, Ddntp específico (A, G, T o C), primers y MgCl2.
* Al unirse el ddntp se corta la cadena.
* Permite saber el posicionamiento de cada nucleótido en el DNA.
* Se puede leer fragamentos de 50-300 nucleótidos
Ddntp
- Sin OH en 3´.
- No permite unión a otro nucleótido.
Secuenciación automatizada
- Secuenciación de Sanger modificada.
- En un solo tubo.
- Cada ddntp esta marcado con un florocromo.
- Se separan las cadenas por talla mediante electroforesis capilar.
Next generation sequencing
- Permiten secuenciar de manera masiva y paralela distintos fragmentos de DNA.
Secuenciación por hibridación → 454 Pirosecuenciación SOLID (Roche), Solexa (Ilumina)
Secuenciación de una sola molécula en tiempo real → SMRT
Pirosecuenciación
- No utliza gel de acrilamida
- Secuencia fragmentos de 200-400 pbs
- Liberación de pirofosfáto → unión de nucleótido a DNA
- dntps no usados son degradados por apirasa
Metodología de la pirosecuanciación
- ADN cortado por enzimas de restricción, unión de adaptadores a los extermos.
- Beads se unen y selecciónan una hebra
- Filtrado de beads (una sola unión)
- Colacación de bead emulcificado + pcr en pocito con dntps
- Brilla cada vez que hay unión
Aisla, fragmenta, liga a adaptadores específicos y hebra sencilla.
Illumina (SOLEXA)
- Amplificación en puente o cluster de PCR
- Se cuenta con fragmentos de DNA adheridos a una célula de flujo.
Ilumina métodología
DNA purificado
Tagmentación → Transposones cortan y colocan adaptadores
Amplificafión de ciclos reducidos→ sitio de unión de la secuencia del primer, index y regiones comlementarias al oligos de la célula de flujo
Clustering → molécula se une a su oligo, primer replica, original es desechada, duplicado se une a otro óligo (puente) y se repite infinitas veces, eliminación de reverse strand
Sequencing by synthesis → 1.- se un primer a primer y se emite una luz (floroforo) por cada unión de dntp, 2.- se elimina el producto, 3.- lectura index 1, 4.- se elimina producto, 5.- se dobla la hebra, 6.- lectura del index y eliminación del producto, 7.- lectura de la hebra doblada, 8.- aliniación y eliminación de foward strand, 9.- repetición de 1-7.
Análasis de data
PCR en emulsión Ion Torrent
- Fragmentación → transposon corta y coloca adaptador
- Unión y replicación en bead (perla emulsificadora + PCR)
- Deposito de cada bead en un pozo del Ion chip
- Cada pozo es llenado con dntps específicos cada 15 segundos, cuando hay unión se libera H+ y se registra el cambio de pH por voltaje.
Beneficios del NGS
- Permite la secuenciación de múltiples sitios a escala masiva
- Millones a billones de fragmentos de DNA secuenciados en una sola reacción.
Cobertura
Promedio de número de lecturas que se alinean en una secuencia de referencia.
Cuantas veces estoy evaluando un fragmento, que tanta certeza tengo, a mayor numero de repetición, mayor precisión.
Profundidad
Número de veces que ha sido secuenciada una base del genoma
