Secuenciación masiva de genomas

Question 1

¿Qué es la secuenciación?

Answer 1

Metodología basada en métodos bioquímicos para determinar el orden del código genético

Question 2

¿Cuándo se creo el método del secuenciación de Sanger?

Answer 2

1977

Question 3

Fundamento del método de secuenciación de Sanger

Answer 3

• Basado en la replicación de la molécula de ADN con ayuda de la ADN polimerasa.
• Adición de dideoxinucleótido no cuentan con el OH en 3´de la ribosa → terminadores
• Provoca la terminación de la cadena de manera aleatoria
• Cada uno de estos ddNTPs están maracdos (al inicio radiactivamente)

Question 4

Metodología de la secuenciación de Sanger

Answer 4

Contenido de cada tubo → Cadena de DNA sencilla, Dntps, DNA polimerasa, Ddntp específico (A, G, T o C), primers y MgCl2.
* Al unirse el ddntp se corta la cadena.
* Permite saber el posicionamiento de cada nucleótido en el DNA.
* Se puede leer fragamentos de 50-300 nucleótidos

Question 5

Ddntp

Answer 5

• Sin OH en 3´.
• No permite unión a otro nucleótido.

Question 6

Secuenciación automatizada

Answer 6

• Secuenciación de Sanger modificada.
• En un solo tubo.
• Cada ddntp esta marcado con un florocromo.
• Se separan las cadenas por talla mediante electroforesis capilar.

Question 7

Next generation sequencing

Answer 7

• Permiten secuenciar de manera masiva y paralela distintos fragmentos de DNA.

Secuenciación por hibridación → 454 Pirosecuenciación SOLID (Roche), Solexa (Ilumina)
Secuenciación de una sola molécula en tiempo real → SMRT

Question 8

Pirosecuenciación

Answer 8

• No utliza gel de acrilamida
• Secuencia fragmentos de 200-400 pbs
• Liberación de pirofosfáto → unión de nucleótido a DNA
• dntps no usados son degradados por apirasa

Question 9

Illumina (SOLEXA)

Answer 9

• Amplificación en puente o cluster de PCR
• Se cuenta con fragmentos de DNA adheridos a una célula de flujo.

Question 10

PCR en emulsión Ion Torrent

Answer 10

• Fragmentación → transposon corta y coloca adaptador
• Unión y replicación en bead (perla emulsificadora + PCR)
• Deposito de cada bead en un pozo del Ion chip
• Cada pozo es llenado con dntps específicos, cuando hay unión se libera H+ y se registra el cambio de pH por voltaje.

Question 11

Beneficios del NGS

Answer 11

• Permite la secuenciación de múltiples sitios a escala masiva
• Millones a billones de fragmentos de DNA secuenciados en una sola reacción.

Question 12

Cobertura

Answer 12

Promedio de número de lecturas que se alinean en una secuencia de referencia.
Cuantas veces estoy evaluando un fragmento, que tanta certeza tengo, a mayor numero de repetición, mayor precisión.

Question 13

Profundidad

Answer 13

Número de veces que ha sido secuenciada una base del genoma