Fundamentos de PCR cuantitativa en tiempo real Flashcards
¿Quién la diseñó?
Kary Mullis
¿En qué consiste?
Técnica de replicación in vitro de una molécula de ADNg.
¿Qué demilita la longitud del fragmento a replicar?
Primers
Cebadores → Oligos
ADNg
ADN genómico normal
PCR convencional
- Amplificación de una región genética específica.
- Gel de agarosa o acrilamida
PCR cualitativo
- Identiificar presencia o ausencia de un fragmento específico.
- Dx de enfermedades infecciosas.
PCR semicuantitativo
- Nivel de expresión de un gen (ARNm) → biopsias
PCR cuantitativo
- Cantidad de microorganismos en ARNm de un gen en particular.
PCR múltiple
- Amplificación de varias regiones génicas en una misma reacción de PCR.
- Cada región cuenta con sus pares de oligos.
Principios básicos de la PCR
- Complementariedad
- Dirección 5´→3´libre
Etapas
- Desnaturalización
- Replicación
- Elongación
PCR vs Sanger
En Sanger el extremo 3´esta bloquedo por ddntps
Componentes necesarios para una PCR
- ADN molde
- Primers u oligos
- DNApol
- dNTPs
- Mg (cofactor)
Aparato usado para provocar la reacción en cadena de la polimerasa
Termociclador
Forma en la qué se encuentran los dNTPs
- Trifosfatada → Estabilidad para formar enlace fosfodiester (N-N)
Concentración de dNTPs necesaria para sintetizar ADN
50-200mM para 6.5-25mg
Pasos para realizar una PCR
- Inicio de la desnaturalización → 95º por 5min.
- 35 ciclos de amplificación → Tem desnaturalización (95º, 30s) y tem alineamiento (50-50ºC, 30-40s), tem extensión (72ºC)
- Amplificación final → 72ºC, llenado de espacios (3mins)
- Almacenamiento temporal (4ºC)
¿Cuántas copias aprox. se obtiene de una sola hebra de DNA en una PCR?
3millones de copias así pasada de chile
Número de copias por ciclo
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Proceso de la PCR tiempo final
- Prepara gel agarosa o acrilamida
- Agregar gel a la cámara y buffer de corrimiento
- Preperar muestras y marcador de PM
- Corrimiento (- → +)
- Comprar bandas de muestras vs PM
¿Quién descubrio la PCR en tiempo real?
Higuchi → modificación de tiempo final
Ventaja de PCR tiempo real
- Se observa eel crecimiento de la curva de amplificación.
- Cualitativa o cuantitativa.
Pasos de la PCR tiempo real
- Amplificación → Desnaturalización, alineamiento y extensión.
- Detección → Florescencia SYBER green o TaqMan.
SYBER GREEN
- Intercalante → Se insertan al medio de la doble cadena.
- Más usado bromuro de etidio.
- Láser → Fluorece
- Entre más ciclos más flourescencia → curva exponencial.
TaqMan
- Identificación de SNPs
- Sonda con floroforo y apagador → región específica.
- Polimerasa se une a primer
- Sonda se complementa al replicar → separación flouroforo y apagador → Luz.
Mecanismo que permite genotipificar
TaqMan
Flourófos de las sondas
- VIC y FAM → reporteros
¿Qué absorbe la luz de los reporteros?
Apagador
¿Qué permite el análisis de la PCR en tiempo real?
Identificar la flourescencia conforme avanza la reacción.
Ventajas de la PCR en tiempo real
- Cálcula eficiencia de la reacción.
- No es necesario correr geles de agarosa para complementar.
- Más rápida y eficaz que punto final
Aplicación de la PCR en tiempo real
- Análisis de expresión → Cáncer
- Investigación → Detección de polimorfismos asociados a enfermedades (E. caso-control)
- Dx → SARS-COV2
