Fundamentos de PCR cuantitativa en tiempo real Flashcards

1
Q

¿Quién la diseñó?

A

Kary Mullis

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2
Q

¿En qué consiste?

A

Técnica de replicación in vitro de una molécula de ADNg.

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3
Q

¿Qué demilita la longitud del fragmento a replicar?

A

Primers
Cebadores → Oligos

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4
Q

ADNg

A

ADN genómico normal

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5
Q

PCR convencional

A
  • Amplificación de una región genética específica.
  • Gel de agarosa o acrilamida
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6
Q

PCR cualitativo

A
  • Identiificar presencia o ausencia de un fragmento específico.
  • Dx de enfermedades infecciosas.
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7
Q

PCR semicuantitativo

A
  • Nivel de expresión de un gen (ARNm) → biopsias
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8
Q

PCR cuantitativo

A
  • Cantidad de microorganismos en ARNm de un gen en particular.
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9
Q

PCR múltiple

A
  • Amplificación de varias regiones génicas en una misma reacción de PCR.
  • Cada región cuenta con sus pares de oligos.
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10
Q

Principios básicos de la PCR

A
  • Complementariedad
  • Dirección 5´→3´libre
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11
Q

Etapas

A
  • Desnaturalización
  • Replicación
  • Elongación
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12
Q

PCR vs Sanger

A

En Sanger el extremo 3´esta bloquedo por ddntps

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13
Q

Componentes necesarios para una PCR

A
  • ADN molde
  • Primers u oligos
  • DNApol
  • dNTPs
  • Mg (cofactor)
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14
Q

Aparato usado para provocar la reacción en cadena de la polimerasa

A

Termociclador

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15
Q

Forma en la qué se encuentran los dNTPs

A
  • Trifosfatada → Estabilidad para formar enlace fosfodiester (N-N)
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16
Q

Concentración de dNTPs necesaria para sintetizar ADN

A

50-200mM para 6.5-25mg

17
Q

Pasos para realizar una PCR

A
  • Inicio de la desnaturalización → 95º por 5min.
  • 35 ciclos de amplificación → Tem desnaturalización (95º, 30s) y tem alineamiento (50-50ºC, 30-40s), tem extensión (72ºC)
  • Amplificación final → 72ºC, llenado de espacios (3mins)
  • Almacenamiento temporal (4ºC)
18
Q

¿Cuántas copias aprox. se obtiene de una sola hebra de DNA en una PCR?

A

3millones de copias así pasada de chile

19
Q

Número de copias por ciclo

A

8

20
Q

Proceso de la PCR tiempo final

A
  • Prepara gel agarosa o acrilamida
  • Agregar gel a la cámara y buffer de corrimiento
  • Preperar muestras y marcador de PM
  • Corrimiento (- → +)
  • Comprar bandas de muestras vs PM
21
Q

¿Quién descubrio la PCR en tiempo real?

A

Higuchi → modificación de tiempo final

22
Q

Ventaja de PCR tiempo real

A
  • Se observa eel crecimiento de la curva de amplificación.
  • Cualitativa o cuantitativa.
23
Q

Pasos de la PCR tiempo real

A
  • Amplificación → Desnaturalización, alineamiento y extensión.
  • Detección → Florescencia SYBER green o TaqMan.
24
Q

SYBER GREEN

A
  • Intercalante → Se insertan al medio de la doble cadena.
  • Más usado bromuro de etidio.
  • Láser → Fluorece
  • Entre más ciclos más flourescencia → curva exponencial.
25
Q

TaqMan

A
  • Identificación de SNPs
  • Sonda con floroforo y apagador → región específica.
  • Polimerasa se une a primer
  • Sonda se complementa al replicar → separación flouroforo y apagador → Luz.
26
Q

Mecanismo que permite genotipificar

A

TaqMan

27
Q

Flourófos de las sondas

A
  • VIC y FAM → reporteros
28
Q

¿Qué absorbe la luz de los reporteros?

A

Apagador

29
Q

¿Qué permite el análisis de la PCR en tiempo real?

A

Identificar la flourescencia conforme avanza la reacción.

30
Q

Ventajas de la PCR en tiempo real

A
  • Cálcula eficiencia de la reacción.
  • No es necesario correr geles de agarosa para complementar.
  • Más rápida y eficaz que punto final
31
Q

Aplicación de la PCR en tiempo real

A
  • Análisis de expresión → Cáncer
  • Investigación → Detección de polimorfismos asociados a enfermedades (E. caso-control)
  • Dx → SARS-COV2