Proteintechniken 6

Question 1

Wie prozessieren Sie Proteine in einem SDS-PA-Gel
für eine Identifizierung mittels Massenspektrometrie?
Welche Rolle spielen dabei die AS Arginin und Lysin?

Answer 1

1. Ausschneiden der Bande mit dem relevanten Protein
2. Entfärben des Proteins
3. Reduktion und Alkylierung
4. Verdauuung des Proteins im Gel durch Trypsin (Restriktionsenzym, schneidet immer C-Terminal von Arginin oder Lysin)
5. Extraktion und Identifizierung mittels Massenspektrometrie

Question 2

Welche Ionenserien entstehen bevorzugt bei einer
collision induced dissociation (CID) Fragmentierung
von Peptiden im Massenspektrometer und welche
Information kann diesen entnommen werden?

Answer 2

b-Ionen entstehen aus N-terminalen Fragmenten, y-Ionen aus C-terminalen.

Massenspektroskopie:
Proteine fliegen durch Gasphase, durch Aufprall auf Gasmoleküle bewirkt zusätzliche Peptidbindungen
(mechanisch)

Question 3

Was versteht man unter Stable Isotope Labeling with

Amino Acids in Cell Culture (SILAC) und wofür benutzt man diese Technik?

Answer 3

Verschiedenen Zellkulturen werden zu verschieden (radioaktiv) markierten AS (z.B. Lysin, Arginin) gegeben, welche von der Zelle eingebaut werden. Diese werden in light und heavy Peptide unterteilt.

-> Mengenbestimmung durch Isotopenmarkierung