DNA Replikation Flashcards
Welche Mechanismen sichern die hohe Genauigkeit von replikativen DNA-Polymerasen beim Inkorporationsschritt?
Ausschluss von Ribonukleotidtriphosphate durch Discriminator-AS im katalytischen Zentrum der DNA-Polymerase
Proofreading
DNA-mismatch-Reparatur: bei unkorrekter Base ist das alpha-Phosphat des Nukleotids ungünstig und kann daher nicht gebunden werden
Konformationsänderung
Stabilisierung durch Mg2+ für beta-gamma-Phosphat geht nicht, wenn falsche Base
Die 3‘-5‘ Exonukleasestelle von DNA-Polymerasen mit proofreading liegt ziemlich weit entfernt von der Polymerisationsstelle. Welche Mechanismen führen zum präferentiellen Ausschneiden falsch eingebauter Nukleotide?
Die Dauer bis die Primer verlängert werden ist länger (höhere Chance in die Exonukleasestelle zu gelangen), wenn eine Fehlpaarung vorliegt (falsche Ausrichtung der Reaktionspartner) zudem sind sie weniger fest gebunden und gelangen so eher in die Exonukleasestelle. Auch korrekt eingebaute Nukleotide können ausgeschnitten werden, aber es liegt eine Präferenz für Fehlpaarungen vor
Welche Aufgaben haben die verschiedenen Enzyme an der prokaryotischen Replikationsgabel? Welche Probleme entstehen durch die Antiparallelität der Stränge der DNA-Doppelhelix und wie wird dieses Problem gelöst (Posaunenmodell)?
Topoisomerase 1/2 verhindert den supercoil der DNA
Helikase trennt die H-Brücken zwischen den Basen
SSB-Proteine (single strand binding) binden und stabilisieren den Einzelstrang
Primase Synthese von Primern
Polymerase 3 Synthese des neuen Stranges
gamma-Komplex/clamp loader (lädt sliding clamp auf DNA)
Polymerase 1 entfernt Primer und legiert die DNA
DNA-Ligase Reifung des lagging strands
Sliding clamps erhöhen die Prozessivität der DNA-Polymerase (halten DNA-Pol an der DNA, wenn diese dissoziieren würde)
RNase H entfernt die Primer, Prozessierung der Okazaki-Fragmente
Der Leitstrang verläuft von 3‘ zu 5‘ und kann kontinuierlich synthetisiert werden. Der Folgestrang läuft von 5‘ zu 3‘ und kann daher nur Stückfür Stück synthetisiert werden. Erst muss ein Bereich frei liegen und ein Primer gelegt werden um diesen zu synthetisieren. Dies geschieht in einzelnen Okazaki Fragmenten.
Welche Proteine findet man an der eukaryotischen Replikationsgabel? Welche dieser Enzyme spielen eine Rolle bei der Reifung von Okazaki-Fragmenten und wie läuft diese Reifung ab?
Präreplikationskomplex (ORC (origin recognition complex) aus cdc 45 und der MCM helicase)
DNA-Ligase 1
Sliding clamp (PCNA)
Clamp loader (RF-c) lädt sliding clamp auf DNA
Polymerase-alpha (Pol 1,2, Pri 1,2; Primase), Pol-delta (lagging strand, bindet an die P-DNA, Reifung der Okazaki-Fragmente), Pol epsilon (leading strand, proof reading), Primase
cdc 45, GINS (Aktivator für cdc-Helikase)
RPA (Replikationsprotein A)
RNase H entfernt zunächst einen Großteil der Ribonukleotide und die 5‘-Exonuklease dann den Rest. Die DNA-Polymerase füllt dann die entstandene Lücke wieder auf und die DNA-Ligase verbindet die DNA Nukleotide wieder mit dem Rest des DNA Moleküls. Bei der Reifung der Okazaki-Fragmente via strand displacement schiebt sich die Polymerase unter die Primer, die Primer knicken nach oben und werden dann von FEN1 abgeschnitten bis der Primer komplett entfernt ist. Eine Ligase verbindet den neuen Strang mit dem alten.
Warum ist die Unterscheidung von neu-synthetisiertem und parentalen Strang notwendig für die Mismatchreparatur? Bei Enterobakterien dient die transiente Hemimethylierung von GATC-Sequenzen dieser Strangunterscheidung. Welche Strukturunterschiede zwischen neu-synthetisiertem und parentalen Strang könnten bei Organismen, die hierfür keine Methylierung verwenden, stattdessen für die Strangunterscheidung genutzt werden?
Die DNA-Mismatch Reparatur benutzt den parentalen Strang als Referenz für einen fehlerfreien Strang weshalb der Fehler auf dem neu-synthetisiertem Strang liegen muss. Zur Strangunterscheidung wird theoretisiert das nicks, gaps und das vorhandensein von RNA (Okazaki-Fragmenten) verwendet werden können.
Wie wird bei Eukaryoten verhindert, dass ein Replikationsursprung zweimal während des Zellzyklus feuert?
Hierfür muss die Möglichkeit geben die prä-Replikationskomplexe (prä-RC) zu beeinflussen. Dies geschieht durch die Aktivität von Cdk. Ist die Cdk-Aktivität gering, können Prä-RC gebildet aber nicht aktiviert werden. Ist sie hoch können prä-RC aktiviert werden aber ihre Bildung ist inhibiert. Im Zellzyklus ist die Aktivität von Cdk während der S, G2 und M Phase hoch (activity phase) und während der G1-Phase niedrig (assembly phase)
Das Genom von Escherichia coli ist ca. 4,6 * 10^6 bp groß. Aus Konjugationsexperimenten (Hfr-Kreuzungen), bei denen das Genom mit nur einer Replikationsgabel im „rolling circle“ -Modus repliziert wird, weiß man, dass diese Replikation 100 Min dauert. Wie schnell muss dann die Replikationsgabel sein? Wenn die Replikationsgabeln bei der „normalen“ Replikation ebenso schnell sind, wie lange dauert dann eine vom oriC gestartete Replikation des E. coli Chromosoms? Diese Zeit ist länger als die Verdopplungszeit von E. coli in der logarithmischen Wachstumsphase (20 Min)? Wie ist dies möglich? Gäbe es auch eine prinzipiell andere Lösung?
Verdopplung von E. coli:
50 Min aufgrund der bidirektionalen Replikation
Logarithmische Wachstumsphase:
Die Replikation ist verschränkt (oris feuern mehrmals hintereinander)
Tochterchromatiden werden direkt wieder repliziert
Nach der Replikation werden mehrere oris abgefeuert, sich teilende Chromosomen werden wieder repliziert
