Nukleinsäuretechniken 4 Flashcards
Wozu und wie führt man Northern-Blot Hybridisierungen durch und welche Methode kann man alternativ einsetzen?
Kurze Erklärung des Prinzips der alternativen Methode.
Northernblot Hybridisierungen werden zur Auftrennung von RNA verwendet. Genauer gesagt zum Nachweis proteincodierender Genexpression bei begrenzter RNA-Anzahl von Proben. Zunächst wird die RNA mithilfe eines Agarose-Gels getrennt, auf eine Membran übertragen (‘geblottet’) und mit markierten (Radioaktivität, Fluoreszenz) Sonden hybridisiert. Die Stärke der Banden gibt Auskunft über die Menge der jeweiligen RNA.
Alternativen sind:
- qRT-PCR: Die mRNA wird revers in cDNA Transkribiert und mit einem Gen-spezifischen Primer über PCR amplifiziert. Die Quantifizierung der mRNA geschieht über die Quantifizierung der cDNA
- Microarrays: Die mRNA wird in markierte cDNA Transkribiert und auf einen Chip mit Sonden übertragen. Die mRNA wird dann über die Fluoreszenz an der für sie spezifischen Sonde quantifiziert.
Wozu und wie führt man Southern-Blot Hybridisierungen durch?
Diese Methode wird zum Nachweis von größeren genetischen Deletionen oder Insertionen, zur Charakterisierung und Verifizierung von Transformationen und zum Prüfen ob homologe Rekombination, ektopische Integration oder Mehrfachintegration vorliegt.
Die DNA wird von einem Gel auf eine Nylon-Membran übertragen (‘geblottet’) und mit Milchpulver vor AK/unspezifischer Bindung geschützt. Im Anschluss wird die DNA mit Sonden hybridisiert um sie unter UV-Licht sichtbar machen zu können. Unterschiedlich lange Banden werden z.B. durch verschiedene Restriktionsenzyme verursacht.
