Metode preučevanja proteinov Flashcards
razlike med proteini
neto naboj (izoelektručna točka), velikosti, afiniteta vezave na ligand
potek ločevanja proteinov
homogenizacija tkiv (tkivo na celice) -> celično frakcioniranje v centrifugi (različni obrati = različne celice/organeli v usedlini) -> ločevanje glede na topnost (z (NH4)2SO4 ali glede na ph) -> odstranjevanje soli z dializo (proti večji koncentraciji pufra) -> ločevanje proteinov s kromatografijo
priprava proteinov v rekombinantni obliki
pripravimo ekspresijski vektor, ki ga vnesemo v baketrijo/kvasovko
definicija kromatografije
fizikalno-kemijski proces, s katerim ločujemo komponente zmesi
sestava in delovanje kromatografije
stacionarna faza in mobilna faza (organsko topilo oziroma v primeru proteinov pufer)
zmes nanesemo na stacionarno fazo, komponente pa potujejo z mobilno fazo glede na afiniteto komponente na stacionarno oziroma mobilno fazo
komponenta šibkeje vezana na stacionarno fazo potuje hitreje
uporaba tankoplastna kromatografija
ločevanje manjših molekul, metabolitov - AK, ogljikovih hidratov, lipidov, vitaminov
delovanje tankoplastne kromatografije
stacionarno plast predstavlja tanka plast silica gela na steklu ali aluminiju, mobilno pa mešanica organskih topil
mobilna faza zaradi kapilarnih sil potuje po stacionarni, snovi, ki so dobro topne v mobilni fazi pa potujejo daleč po stacionarni fazi
pomen retencijskega faktorja
razmerje med dolžino poti komponente po stacionarni fazi in dolžino poti mobilne faze
S katero metodo ločujemo proteine?
s tekočinsko kromatografijo
sestava tekočinske kromatografije
mobilna faza je tekoča, stacionarna je trda in se nahaja v kolonah
nosilec je po navadi celulozni ali agarozni, mobilna faza je po navadi pufer
tlak pri tekočinski kromatografiji
lahko je normalen, ali pa 340 atm (HPLC)
absorbanca zaznavanja proteinov
pri 200 nm , saj tam absorbira peptidna vez
aromatične AK pri 280 nm
metoda ločevanja proteinov po razlikah v naboju
ionska izmenjevalna kromatografija
delovanje ionske izmenjevalne kromatografije
proteini imajo pri različnih pH različen naboj (pod pI so pozitivno nabiti) in v stacionarni fazi imamo ionske izmenjevalce (polimeri z nabitimi funkcionalnimi skupinami
iz stacionarne faze proteine ločimo z gradientom pH ali gradientom ionske moči
uluiranje poteina je odvisno od naboja - večji kot je naboj, večjo ionsko moč potrebujemo
tipi ionskih izmenjevalcev
1) kationski izmenjevalci (vezane negativne skupine)
2) anionski izmenjevalci (vezane pozitivne skupine)
metoda ločevanja proteinov glede na velikost
gelska filtracija
sestava gelske filtracije
stacionarna faza je molekularno sito (dekstran), iz velikih polimernih kroglic
majhne molekule se ujamejo v te polimerne kroglice, velike pa potujejo nad njimi (potujejo dlje)
elucijski volumen
volumen, pri katerem eluiramo protein
povezava elucijskega volumna in desetiškega logaritma molekulske mase
obratno sorazmeren (veliki proteini se najprej sperejo)
metoda ločevanja proteinov glede na afiniteto vezave do liganda
afinitetna kromatografija
delovanje afinitetne kromatografije
v stacionarni fazi imamo vezane ligande, ki specifično integrirajo z določenim proteinom, ki ga proučujemo
uporaba afinitetne kromatografije
ločevanje rekombinantnih proteinov
priprava rekombinantnih proteinov
na njih vežemo histidinski repek ali obliko fuzijskih proteinov (GTS)
uporabimo stacionarno fazo, ki ima vezan glutation
(protein se z GTS veže na glutation)
s pufrsko raztopino speremo protein/GTS s stacionarne faze in uporabimo pepidazo, ki cepi GTS in protein - dobimo čisti protein
Kaj pridobimo s postopkom ločevanja proteinov?
povečuje se čistost in specifična aktivnost proteina
metode preverjanje čistosti proteina
poliakrilamidno gelsko elektroforezo (NaDS PAGE)
delovanje NaDS PAGE
poliakrilamidni gel in pufer za nanos vsebujeta detergent (natrijev dodecilsulfat), ki denaturira proteine - proteini dobijo enak naboj na enoto mase in jih zato lahko ločujemo zgolj po velikosti
NaDS povzroči tudi negativen naboj vseh proteinov - potujejo k anodi
Kako vizializiramo proteine?
z barvili
elektroforeza pri kateri ne dodamo NaDS
nativna elektroforeza
določanje molske mase proteinov
s pomočjo NaDS PAGE na gel nanesemo proteinske standarde in določimo, kako daleč so prepotovali določeni standardnih mas
izračunamo desetiški logaritem mas standardov in narišemo graf Mr(pot)
metoda dvodimenzionalne poliakrilamidne gelske elektroforeze (NaDS 2D-PAGE)
proteine ločimo glede na naboj in maso
stacionarna faza je narejena kot pH gradient - najprej v eni dimenziji ločimo proteine glede na naboj (vklopimo električno polje in proteini potujejo k tisti vrednosti pH, ki ustreza pI točki proteina) -> pri nizki pH je pozitivni pol polja, saj imajo proteini pri ph < pI pozitiven naboj in bodo potovali h katodi
v drugi dimenziji ločimo proteine glede na velikost, enako kot pri NaDS PAGE
Kako po 2D-PAGE vizualiziramo proteine?
barvilom ali pa izrežemo lise in napravimo masno spektrometrijo
masna spektrometrija proteinov
proteine najprej ioniziramo, nato pospešimo v električnem polju
ko dosežejo zadostno kinetično energijo, izklopimo električno polje in vklopimo magnetno polje
v magnetnem polju se nabiti proteini odklonijo, glede na razmerje m/z
lahki ioni in ioni z večjim nabojem se v magnetnem polju zelo odklanjajo in jih zato vidimo na začetku masnega spektra
določanje zaporedja aminokislin z masno spektrometrijo
protein najprej tretiramo s proteazo, da dobimo kratke polipeptidne verige, raztopino peptidov pa nato damo v napravo, ki je zaporedje dveh masnih spektrometrov
najprej peptide ioniziramo in jih z masno spektrometrijo ločimo, tako da nam ostane samo peptid, ki ga želimo preučevati
željen peptid dobimo v celici za trke, kjer ga obstreljujemo z inertnim plinom in ga dodatno cepimo
v drugem spektrometru ponovno izmerimo fragmente, dobimo vrhove, ki ustrezajo m/z zaporedju AK
določanje 3D strukture proteina
rentgenska difrakcija, kjer dobimo vzorec uklonjenih rentgenskih žarkov, iz tega vzorca pa lahko sklepamo na 3D strukturo proteina
