Metode preučevanja proteinov

Question 1

razlike med proteini

Answer 1

neto naboj (izoelektručna točka), velikosti, afiniteta vezave na ligand

Question 2

potek ločevanja proteinov

Answer 2

homogenizacija tkiv (tkivo na celice) -> celično frakcioniranje v centrifugi (različni obrati = različne celice/organeli v usedlini) -> ločevanje glede na topnost (z (NH4)2SO4 ali glede na ph) -> odstranjevanje soli z dializo (proti večji koncentraciji pufra) -> ločevanje proteinov s kromatografijo

Question 3

priprava proteinov v rekombinantni obliki

Answer 3

pripravimo ekspresijski vektor, ki ga vnesemo v baketrijo/kvasovko

Question 4

definicija kromatografije

Answer 4

fizikalno-kemijski proces, s katerim ločujemo komponente zmesi

Question 5

sestava in delovanje kromatografije

Answer 5

stacionarna faza in mobilna faza (organsko topilo oziroma v primeru proteinov pufer)
zmes nanesemo na stacionarno fazo, komponente pa potujejo z mobilno fazo glede na afiniteto komponente na stacionarno oziroma mobilno fazo
komponenta šibkeje vezana na stacionarno fazo potuje hitreje

Question 6

uporaba tankoplastna kromatografija

Answer 6

ločevanje manjših molekul, metabolitov - AK, ogljikovih hidratov, lipidov, vitaminov

Question 7

delovanje tankoplastne kromatografije

Answer 7

stacionarno plast predstavlja tanka plast silica gela na steklu ali aluminiju, mobilno pa mešanica organskih topil
mobilna faza zaradi kapilarnih sil potuje po stacionarni, snovi, ki so dobro topne v mobilni fazi pa potujejo daleč po stacionarni fazi

Question 8

pomen retencijskega faktorja

Answer 8

razmerje med dolžino poti komponente po stacionarni fazi in dolžino poti mobilne faze

Question 9

S katero metodo ločujemo proteine?

Answer 9

s tekočinsko kromatografijo

Question 10

sestava tekočinske kromatografije

Answer 10

mobilna faza je tekoča, stacionarna je trda in se nahaja v kolonah
nosilec je po navadi celulozni ali agarozni, mobilna faza je po navadi pufer

Question 11

tlak pri tekočinski kromatografiji

Answer 11

lahko je normalen, ali pa 340 atm (HPLC)

Question 12

absorbanca zaznavanja proteinov

Answer 12

pri 200 nm , saj tam absorbira peptidna vez

aromatične AK pri 280 nm

Question 13

metoda ločevanja proteinov po razlikah v naboju

Answer 13

ionska izmenjevalna kromatografija

Question 14

delovanje ionske izmenjevalne kromatografije

Answer 14

proteini imajo pri različnih pH različen naboj (pod pI so pozitivno nabiti) in v stacionarni fazi imamo ionske izmenjevalce (polimeri z nabitimi funkcionalnimi skupinami
iz stacionarne faze proteine ločimo z gradientom pH ali gradientom ionske moči
uluiranje poteina je odvisno od naboja - večji kot je naboj, večjo ionsko moč potrebujemo

Question 15

tipi ionskih izmenjevalcev

Answer 15

1) kationski izmenjevalci (vezane negativne skupine)

2) anionski izmenjevalci (vezane pozitivne skupine)

Question 16

metoda ločevanja proteinov glede na velikost

Answer 16

gelska filtracija

Question 17

sestava gelske filtracije

Answer 17

stacionarna faza je molekularno sito (dekstran), iz velikih polimernih kroglic
majhne molekule se ujamejo v te polimerne kroglice, velike pa potujejo nad njimi (potujejo dlje)

Question 18

elucijski volumen

Answer 18

volumen, pri katerem eluiramo protein

Question 19

povezava elucijskega volumna in desetiškega logaritma molekulske mase

Answer 19

obratno sorazmeren (veliki proteini se najprej sperejo)

Question 20

metoda ločevanja proteinov glede na afiniteto vezave do liganda

Answer 20

afinitetna kromatografija

Question 21

delovanje afinitetne kromatografije

Answer 21

v stacionarni fazi imamo vezane ligande, ki specifično integrirajo z določenim proteinom, ki ga proučujemo

Question 22

uporaba afinitetne kromatografije

Answer 22

ločevanje rekombinantnih proteinov

Question 23

priprava rekombinantnih proteinov

Answer 23

na njih vežemo histidinski repek ali obliko fuzijskih proteinov (GTS)
uporabimo stacionarno fazo, ki ima vezan glutation
(protein se z GTS veže na glutation)
s pufrsko raztopino speremo protein/GTS s stacionarne faze in uporabimo pepidazo, ki cepi GTS in protein - dobimo čisti protein

Question 24

Kaj pridobimo s postopkom ločevanja proteinov?

Answer 24

povečuje se čistost in specifična aktivnost proteina

Question 25

metode preverjanje čistosti proteina

Answer 25

poliakrilamidno gelsko elektroforezo (NaDS PAGE)

Question 26

delovanje NaDS PAGE

Answer 26

poliakrilamidni gel in pufer za nanos vsebujeta detergent (natrijev dodecilsulfat), ki denaturira proteine - proteini dobijo enak naboj na enoto mase in jih zato lahko ločujemo zgolj po velikosti
NaDS povzroči tudi negativen naboj vseh proteinov - potujejo k anodi

Question 27

Kako vizializiramo proteine?

Answer 27

z barvili

Question 28

elektroforeza pri kateri ne dodamo NaDS

Answer 28

nativna elektroforeza

Question 29

določanje molske mase proteinov

Answer 29

s pomočjo NaDS PAGE na gel nanesemo proteinske standarde in določimo, kako daleč so prepotovali določeni standardnih mas
izračunamo desetiški logaritem mas standardov in narišemo graf Mr(pot)

Question 30

metoda dvodimenzionalne poliakrilamidne gelske elektroforeze (NaDS 2D-PAGE)

Answer 30

proteine ločimo glede na naboj in maso
stacionarna faza je narejena kot pH gradient - najprej v eni dimenziji ločimo proteine glede na naboj (vklopimo električno polje in proteini potujejo k tisti vrednosti pH, ki ustreza pI točki proteina) -> pri nizki pH je pozitivni pol polja, saj imajo proteini pri ph < pI pozitiven naboj in bodo potovali h katodi
v drugi dimenziji ločimo proteine glede na velikost, enako kot pri NaDS PAGE

Question 31

Kako po 2D-PAGE vizualiziramo proteine?

Answer 31

barvilom ali pa izrežemo lise in napravimo masno spektrometrijo

Question 32

masna spektrometrija proteinov

Answer 32

proteine najprej ioniziramo, nato pospešimo v električnem polju
ko dosežejo zadostno kinetično energijo, izklopimo električno polje in vklopimo magnetno polje
v magnetnem polju se nabiti proteini odklonijo, glede na razmerje m/z
lahki ioni in ioni z večjim nabojem se v magnetnem polju zelo odklanjajo in jih zato vidimo na začetku masnega spektra

Question 33

določanje zaporedja aminokislin z masno spektrometrijo

Answer 33

protein najprej tretiramo s proteazo, da dobimo kratke polipeptidne verige, raztopino peptidov pa nato damo v napravo, ki je zaporedje dveh masnih spektrometrov
najprej peptide ioniziramo in jih z masno spektrometrijo ločimo, tako da nam ostane samo peptid, ki ga želimo preučevati
željen peptid dobimo v celici za trke, kjer ga obstreljujemo z inertnim plinom in ga dodatno cepimo
v drugem spektrometru ponovno izmerimo fragmente, dobimo vrhove, ki ustrezajo m/z zaporedju AK

Question 34

določanje 3D strukture proteina

Answer 34

rentgenska difrakcija, kjer dobimo vzorec uklonjenih rentgenskih žarkov, iz tega vzorca pa lahko sklepamo na 3D strukturo proteina