Encimska kinetika, dvosubstratne reakcije in encimski inhibitorji Flashcards
Kaj obravnava encimska kinetika?
hitrost encimsko kataliziranih reakcij oziroma hitrost, s katero se substrat pretvori v produkte
načini sledenja sprememb koncentracij substrata/produkta
1) absorbanca v UV ali vidnem spektru
2) flourescenca
3) radioaktivnost
enota aktivnosti
U… 1 U = 1 mikromol/min
kat … 1 kat = 1 mol/s
hitrost encimsko katalizirane reakcije predstavlja X.
X… aktivnost
dejavniki, ki jih moramo upoštevati pri merjenju encimske aktivnosti
1) pH
2) T
3) [substrat]
4) ionska moč
Kako podajamo aktivnost v telesnih tekočinah?
U/L
Kako podajamo specifično aktivnost v telesnih tekočinah?
U/mg
sprememba aktivnosti in specifične aktivnosti s potekom reakcije
aktivnost ostaja ves čas enaka, specifična aktivnost se povečuje s potekom reakcije
definicija začetne hitrosti reakcije
tangenta na krivuljo v času t=0
Kdaj je Km = [S]?
ko je v(0) = 1/2 v(max)
primerjava [E] in [S]
[E] je običajno nm
[S] = 105-106x[E]
ključen pogoj za encimsko katalizo
nastanek ES kompleksa
Čemu je proporcionalna hitrost encimske katalize?
razpadu ES kompleksa, saj je to najpočasnejši proces reakcijskega mehanizma
Michaelis-Mentenov eksperiment
- prvi biokemijski eksperiment s pufrskim uravnavanjem
- izpeljava enačbe za v(0) preko koncentracije substrata, maks hitrosti in Km
- k(-2) ne upoštevamo, ker je [P] pri t=0 tudi 0
Briggs-Haldane dopolnilo Michaelis-Menten teorije
teorija stacionarnega stanja
teorija stacionarnega stanja
po kratkem času v reakcijski zmesi se vzpostavi ravnotežje med nastankom in razpadom ES kompleksa - ko se hitrosti izenačita dobimo stacionarno stanje
kinetični red nastanka in razpada ES kompleksa
nastanek ES kompleksa poteka po kinetiki drugega reda
razpad ES kompleksa poteka po kinetiki prvega reda
pogoj za maksimalno hitrost reakcije
ves encim se pretvori v ES kompleks
razlaga saturacijske kinetike
pri majhnih [S] se hitrost z dodatkom substrata izrazito spreminja, saj lahko S takoj tvori ES kompleks z E
ko je večina encima že v kompleksu dodajanje S hitrost le malo poveča
ko je encim saturiran s S, dodajanje substrata nima vpliva na hitrost
vloga Michaelis-Menten krivulje
poda nam, kako je hitrost odvisna od koncentracije substrata
kinetični red reakcije v odvisnosti od [S], ko je [S] majhna
prvi red - skoraj ni ES kompleksa, zanemarimo ga
kinetični red reakcije v odvisnosti od [S], ko je [S] velika
ničti red - praktično ves encim zasičen
Kaj nam pove Km?
afiniteto encima do vezave substrata (velik Km - majhna afiniteta in obratno)
pomen k(kat) oz k(2)
pove nam število molekul substrata, ki se pretvorijo v produkt na eni molekuli encima v enoti časa, ko je encim nasičen s substratom
imenujemo ga tudi pretvorbeno število
definicija izoencimov
encimi, ki katalizirajo isto reakcijo, a se razlikujejo po kinetičnih parametrih in molekulskih lastnostih
primer izoencima
laktat dehidrogenaza (iz 4 podenot - 5 encimi)
Kaj nam podaja učinkovitost encima?
hitrostna konstanta (k(kat)) oziroma najpočasnejša stopnja v encimsko katalizirane reakcije
najpočasnejši korak v encimski reakciji
ES v EP ali EP v E + P –> transformacija S v P ali sprostitev produkta z encima
Zakaj Km in k(kat) nista primerna parametra za primerjavo katalitične učinkovitosti?
Km je podobna koncentraciji substrata v celici
encimi imajo lahko enako k(kat), ampak drugačne hitrosti nekataliziranih reakcij in zato reakcije ne pospešijo enako hitro
parameter za primerjavo katalitične aktivnosti
encimska konstanta specifičnosti - k(kat)/Km
Encimska konstanta specifičnosti je hitrostna konstanta za katero pretvorbo?
E + S –> E + P
kinetična reda k(kat) in encimsko konstanto specifičnosti
k(kat) - prvi red
EKS - drugi red
Kaj omejuje hitrost katalize?
difuzija oziroma hitrost, s katero se srečata substrat in encim
kvantitativna vrednost difuzijske omejitve
10^8 - 10^9
perfektna kataliza
perfektno katlizo dosežejo encimi, ki imajo EKS blizu difuzijske limite
Ali Michaelis-Menten kinetika velja za bisubstratne reakcije?
Da, a zgolj, če je koncentracija enega od substratov konstanta
mehanizmi dvosubstratnih reakcij
1) ternarni
2) ping-pong
ternarni mehanizem
na encim se najprej veže en substrat, kasneje pa še drugi, poteče reakcija in iz encima se sprostijo produkti
encimi, ki delujejo s ternarnim mehanizmom
dehidrogenaze in kinaze
specifični ternarni mehanizmi
vrstni red vezave substratov je pomemben - v obratnem vrstnem redu vezave je pomemben
ping-pong mehanizem
na encim se veže prvi substrat, poteče reakcija in sprosti se prva skupina produktov, na modificiran encim z novo vezano funkcionalno skupino se vee drug substrat, ki sprejme funkcionalno skupino in odcepi se druga skupina produktov
reakcije ping-pong mehanizma in encimi, ki delujejo pod tem mehanizmom
kovalentne hidrolize (hidrolaze, transaminaze, transketolaze)
grafično diagnosticiranje mehanizmov bisubstratnih reakcij
Lineweaver-Burkovi diagrami
primerjava Lineweaver-Burkovih diagramov ternarnih in ping-pong mehanizmov
ternarni mehanizem - linije se sekajo
ping-pong mehanizem - linije so vzporedne
risnaje Lineweaver-Burkovih diagramov
zmerimo spreminjanje začetne hitrosti reakcij, ko spreminjamo [S1] pri konstantni [S2], ob različnih [S2]
Kateri encimi sledijo Michaelis-Menten kinetiki?
Encimi, ki imajo samo eno aktivno mesto oziroma neodvisna aktivna mesta in so iz ene polipeptidne verige (drugi delujejo alosterično oziroma regulatorno)
definicija inhibitorjev
spojine, ki znižajo hitrost encimsko kataliziranih reakcij
tipi inhibitorjev glede na vezavo
1) ireverzibilni (kovalentne povezave)
2) reverzibilni (šibke povezave)
tipi inhibicije glede na mehanizem delovanja
1) kompetitivna
2) akompetitivna
3) mešana
mehanizem delovanja kompetitivnih inhibitorjev
strukturno so podobni substratu, zato z njim tekmujejo za vezavo na aktivno mesto encima
s tem povečajo Km in zmanjšajo afiniteto ter hitrost poteka, a ne vplivajo na maksimalno hitrost reakcije
primer kompetitivnega inhibitorja
ivostatin
mehanizem delovanja akompetitivnih inhibitorjev
vežejo se lahko zgolj na ES kompleks, ne na E samostojno
znižajo maksimalno hitrost in povečajo afiniteto
primer akompetitivnega inhibitorja
metotreksat
mehanizem delovanja mešane inhibicije
inhibitor se lahko veže na encim ali pa ES kompleks
spremeni se Km, zniža se maksimalna hitrost
vrsta mešane inhibicije
nekompetitivna inhibicija (vpliv samo na maksimalno hitrost)
primerjava Lineweaver-Burkovih diagramov pri različnih tipih inhibicije
- kompeitivna = črte se sekajo
- akompetitivna = črte so vzporedne
Kateri inhibitorji delujejo ireverzibilno?
Tisti, ki se na encim vežejo s kovalentnimi vezmi
primeri ireverzibilnih inhibitorjev kot zdravil
acetilsalicilna kislina (aspirin) in NSAID
delovanje aspirina kot inhibitorja
aspirin acetilira serin na COX (ciklooksigenaza) in s tem prepreči njegovo aktivnost
primeri ireverzibilnih inhibitorjev kot strupov
- diizofluorofosfaz se veže na serin v esterazah in deluje nevrotoksično
- parathion in malathion (pesticida) sta inhibitroja acetilholin esteraze
- sarin in tabun (vojna strupa) sta inhibitroja acetilholin esteraze
pomen acetilholin esteraze
katalizira hidrolizo acetilholina v sinaptični špranji na etanojsko kislino in holin (če je inhibirana se zadušimo)
samomorilski inhibitorji
inhibitorji, ki izrabijo mehanizem encimske reakcije, da se aktivirajo in kasneje inaktivirajo isti encim
primer samomorilskega encima
diflourometilornitin
uporaba in delovanje diflourometilornitina
uporablja se v terapiji spalne bolezni, ki jo povzroča putrescin, ki nastane z dekarboksilacijo ornitina (ornitin dekarboksilaza in PLP). DFMO posnema ornitin do stopnje, ko se aminska skupina veže na PLP, po dekarboksilaciji se encim inhibira
analogi prehodnega stanja
ti enicmi se s šibkimi interakcijami, a veliko močneje, saj je njihovo osnovno stanje strukturno podobno PS substrata, vežejo na substrat
primer analoga predhodnega stanja in njegovo delovanje
fosfoglikolohidroksamat cepi fruktozo-1,6-bifosfat na gliceraldehid-3-fosfat in dihidroksiaceton fosfat
zdravljenje odvisnosti od kokaina z analogi predhodnega stanja
kokain se počasi hidrolizira v nekoristna produkta, nimamo pa encima, ki bi reakcijo popešil, zato so z APS želeli z imunizacijo pridobiti katalitična protitelesa
katalitična protitelesa imajo na svoji površini odtis substrata v PS, zato so domnevali, da bodo taka protitelesa uspešno vezala kokain v njegovem PS in s tem katalizirali hidrolizo
ni uspelo :(
