F7 DNA metoder Flashcards
Single nucleotide polymorphism (SNP)
DNA markør:
Variationer af placering af et nukleotidposition på et kromosom
ATTCCG (befolkning)
AATCCG (få individer)
Minder meget om punktmutation:
- Baseudskiftning i DNA
fx med ATTCCG –> AATCCG
Funktion:
- Silence mutations
- Ændrer ikke et proteins funktion og udseende
Mikrosatellit ustabilitet Microsatellite instability (MSI)
Hvor generne hypermuterer, hvilket resulterer i beskadiget DNA repair cellerne
Repetitivt DNA
DNA sekvenser der gentages flere gange igennem genomet
VNTR
Variable Number of Tandem Repeats
Variabelt antal repeats efter hinanden
- Mikrosatellit (2-5bp)
Komplementær base-parring kan identificere antallet af specifikke enheder i gDNA (genomisk DNA)
Analysen udføres på isoleret gDNA
Man benytter enten SB eller PCR
- Southern blot med probe, der er komplementær med Tandem Repeat-sekvenserne
eller
- PCR med primere der er modsatte af Tandem Repeat-sekvensen
Restriktion fragment længde polymorfi (RFLP)
Minisatellitter (20-70bp)
Gerningsmand finger:
Bestemte restriktionsenzymer klipper/kløver DNA op i kortere del.
De analysere derefter i gel og man kan se forskel på forbryderen eller syg og rask gen.
Det er derfor RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfi) man benytter i en Gel-elektroforese
PCR (Polymerase Chain Reaction)
DNA metode:
Efterlignet replikation af DNA: 4 steps:
PBPE Pikken Boller Peter Eww
P 1. Primer tilsættes
- Byggesten for DNA tilsættes: dNTP
- DNA polymerase tilsættes og der laves 40 kopier/cyklusser ved tre steps:
- Denaturering 95’ (DNA adskilles)
- Annealing 55’ (Primer på template DNA)
- Elongering 75’ (Syntisering af DNA) - Elektroforese adskiller DNA
PCR uddybet version:
Trin i PCR: PR3G - Prøv Røvhullet 3 Gange!
- Primere
- Reaktionsbuffer
- 3step
- Gentage cyklusser
A. To primere syntiseres så de er komplimentere med hver deres DNA-streng
B. Reaktionsbuffer
- Mixing af primere i reaktionsbuffer med:
- DNA
- DNA polymerase
- dNTP
C.:
- Denaturering
- Annealing
- Elongering
CI. Denaturering (96’)
- DNA bliver enkeltstrenget
CII. Annealing (58’)
- Primere bindes til DNA strengen
CIII. Elongering (74’)
- DNA polymerase virker optimalt
- Afgør hvor mange nukleotider primerne bliver forlænget med
D. Gentagne cyklusser
- DNA stykket bliver massivt kopieret
Southern blot (SB)
DNA metode:
Søger efter variationer i specifikke dele af DNA og bygger på komplementær baseparring.
Kigger efter repeteret (repetitivt) DNA.
Southern Blot = Skide Bagdel:
KEB HEB
Klør Esbergesere Bollerne Hahaha Eller Bagdelen
- Kløvning (deler)
Restriktionsenzymer (RE) kløver/deler) DNA deles op i enkelte separate DNA strenge i agarose gel - Elektroforese
- Adskiller fragmenterne ved denaturering - Blotting
- Overførsel fra gel til nylon-membran - Hybridisering
- Tilføjer radioaktiv DNA probe
En probe (enkeltstrenget DNA som er komplementær med sekvensen man vil finde)
- Eksponering
Røntgenfilm
- Signal fra proben identificeres ved røntgenfilm (giver båndmønster) - Båndmønster
- Autoradiografi
Bruges til at bestemme RFLP til at amplificere et resultat.
Et i-mange-stykker klippet DNA vil bare give et diffust elektroforese resultat, DNA overføres fra gel til en membran og en probe (udvalgt stykke af DNA).
De udvalgte prober kan (radioaktivt mærket) tilføres et DNA produkt og ved deres kobling til komplimentær DNA, amplificerer deres mærkning resultat
Gel elektroforese
Forskel mellem positiv og negativ spænding.
De korte vandrer nederst og længst mod plus-enden.
De lange forbliver øverst mod minus-enden.
DNA molekyler er altid negativt ladet –> Derfor vandrer de mod den positive ladede ende.
- Påsætning af prøve
- Agarose gel - Elektroforese
- Visualisering under UV-lys
- Langt bånd, kort bånd
Restriktionsenzymer
Klipper/kløver specifikke DNA sekvenser ud af DNA’et
Restriktionskort
Overordnet kort over restriktionssite over DNA
DNA sekventering (dideoxy sekventering)
DNA metode:
Identificere rækkefølgen af baser i et bestemt DNA-sekvens med FARVER (fx. et gen)
De enkelte basesekvenser (A,T,G,C) kan gengives i 4 forskellige faser.
- Metoden benytter centrale elementer fra PCR
AED - Hjertestarter!
- Annealing
- Primer bindes til DNA template - Elongering
- DNA-polymerase forlænger primer, da DNA polymerase virker optimalt ved 74’C - Denaturering
- Cyklus fortsætter herefter
Der kræves:
- DNA template (enkeltstrenget DNA)
- DNA polymerase
- dNTP og ddNTP
- Primer
- Buffer
Microarray (genom/epigenomanalyser)
DNA metode:
Kan bruges til at analysere hele genomet.
Er en lille glasplade med 1000 huller i, som indeholder syntetiseret DNA sekvenser.
Hvert hul reagerer på et specifikt DNA sekvens som man ved er SYGT DNA.
De huller der er komplimentære til cDNA reagerer = Sygt DNA.
RT-PCR
Metode at gå fra mRNA til cDNA.
Metode til at undersøge RNA og om RNA udtrykker det korrekte sekvens.
Reverse Transkription PCR
cDNA syntese
Man danner cDNA ud fra Reverse Transkriptase (fx RT-PCR), hvor vi kun har EXONS.
((Måske rigtigt?
:
Går videre til enten PCR eller qPCR
PCR: Splejsning (intron tilbageholdes)
qPCR: Ekspression (exon skippes over)
q: quantitativ))
Plasmid
En bakteries enkeltstrenget/dobbeltstrenget, DNA molekyle.
Kan kopiere sig selv (ligesom menneskets DNA)
Primer
10 bp langt Protein der starter DNA syntese.
Anvendes næsten kun i PCR metode.
Oligonukleotid
En DNA sekvens.
En kort kæde af nukleotider på 5-50bp langt.
Et kort stykke RNA/DNA, kan bl.a. bruges til PCR
Denaturering
Man hæver temperaturen til 96’, så man kan adskille dobbeltstrenget DNA.
- Hybridisering
- Annealing
I hvilke metoder bruges de hver især?
- Bruges i Southern Blot
- Proben, som er mærket med radioaktiv eller fluorescerende signal tilsættes en nylon-membran
- Bruges i PCR
- En primer tilhæfter sig enkeltstrenget DNA, hvorefter en DNA polymerase sætter sig på og vi kan få syntetiseret DNA.
DNA profil
Et lille sæt af DNA variationer, som altid bliver forskellig fra menneske til menneske
Kaldes også forensic DNA profile, da det bruges af retsmedicinere.
Små VNTR og mikrosatellitter
Revers transkriptase
Enzym man bruger til at danne cDNA
FISH (Fluorescence In-Situ Hybridization)
Kan analysere 300.000 bp og opaf.
FISH og SKY bruger man til at analysere metafasekromosomerne
Anvendelsemuligheder af FISH:
- Translokation
- Deletion
- Duplikation
- Lokation af unik DNA-sekvens (gen-lokalisering)
- Kønsbestemmelse
- Aneuploidi undersøgelse
BDCF-ODH
Boller Drengen Carlos Fisser Om Dagen hårdt?
- Blodprøve
- Dyrkning af celler
- Tilsæt Colchicin
- Ødelægger téntrådsapparatet –> celledelingerne stoppes
- Metafasekromosomer kan analyseres - Fiksér celler
- Fastfrysning af cellerne - Spred celler på præparatglas vha. ‘‘dråbeteknik’’
- Denaturering
- DNA strengene i metafase-kromosomerne - Hybridrisering med fluorescerende denatureret probe
- Der vil komme 4 signaler fordel at de to homologe kromosomer har 2 hver = Ét på hvert søsterkromatid
Restriktionsenzymer
Nogle bakterier har specielle enzymer, som kan dele den dobbeltstrengede DNA
Restriktionsenzymerne kan genkende bestemte palindrome sekvenser (4-8 bp) og dele dem, så man har 2 af hver.
Palindrome (CAT TAC), man kan skrive ordet bagfra.
Madam I’m Adam
Otto, Anna, Radar
Probe
En lille del af et DNA stykke (udsnit)
En Probe er komplementær til den DNA streng, man ønsker at identificere / detektere.
Restriktionskort
En oversigt over stederne restriktionsenzymerne klipper
- For at kunne orientere sig i meget lange DNA-sekvenser
- DNA’et kløves med RestriktionsEnzymer
Elektroforese
Agarose-gel med ehtidium bromid, med tilslutning strøm lader DNA vandre ned genenm gel og fordeler sig ifht. længden af DNA produktet.
Har man en mutation i fx en DNA streng, vil EcoR1 ikke kunne skære det over og elektroforese vil afsløre at DNA er blevet ‘‘for langt’’
Vektor
Medie for transport af DNA
En virus tømt for naturligt forekommende DNA er hyppigt valg ifht. Genterapi
DNA markør
Et sted på et gen hvor der findes en sekvens som man kender, som man kan udpege og genkende igen
Mikrosatellitmarkører
DNA markør:
Benyttes ved at se forskel på menneskers IKKE-kodende DNA!
3 forskellige VNTR (Variable Numer of Tandem Repeats):
- Satellit DNA
- Minisatellit DNA (20-25bp)
- Mikrosatellit DNA (2-5bp)
Gentagelser af DNA sekvenser
Bruges i PCR
At amplificere
At danne nyt
SKY
Spektral Karyotypebestemmelse
SKY og FISH bruges til at analysere metafasekromosomer
24 farvede karyotyperinger
Man kan se:
- Reciprok translokationer
- Translokationer
- Robertsonian translokationer
- Duplikationer
Båndfarvning
Farvning af kromosomer, hvor det ligner at kromosomerne får et svedbånd rundt om armen/benet.
Det er en teknik, der giver anledning til fremkomst af kromosomspecifikke båndmønster.
Tjekker for store additioner, deletioner, translokationer etc. på KROMOSOMAL niveau.
Krydskonfiguration
Arrangement af ubalance kromosomer pga. recibrok translokation
En parringsfigur af kromosomer. Når deling sker - er alle kombinationer mulige.
En skitsetegning hvor alt der er homolog passer sammen.
In Situ Hybridisering
Kortlægge geners abnormaliteter
Molekylær genkortlægningsteknik hvor mærkede prober er hybridiseret til farvede metafasekromosomer.
Derefter udsat for røntgenfilm for at vise probens placering.
CGH
Comparativ Genom Hybridisering - Man sammenligner SYG med RASK
Bruges til: ADDT - Addition - Deletion - Duplikation - Translokation Men IKKE balancerede afvigelser som fx RECIPROK TRANSLOKATION (CGH array bruges til mindre ting)
Fordele:
- Sammenligning af DNA
- Ikke behov for replikation
- Man behøver ikke at vide hvad man leder efter
Ulemper:
- Viser alt over 5-10Mbp
- Dårlig opløsning (over 5 mio. bp)
- Viser ikke balancerede afvigelser på kromosom niveau
Hvis en mutation er til stede hvad ville man bruge af DNA markører hvis udgangsmaterialet er:
- cDNA
- gDNA
- PCR og gel elektroforese
På denne måde får vi amplificeret/kopieret genet nok gange til at se DNA sekvenserne, når de kører gennem en gel.
Ved at sammenligne med en rask kontrolperson vil vi kunne se at mutationen er til stede.
Man ser forskellen ved at DNA stykkerne fra test-personen er kortere og kommer højere/længere op i gelen
- Vi kan lave en RFLP
Restriktionsenzymerne vil ikke klippe der hvor mutationen er –> en for lang DNA sekvens.
Gel + sammenligne med rask kontrol person
