Laboratoriumtechnieken: eiwitten Flashcards
Hoe kijk je op DNA, RNA en eiwit niveau?
DNA: genotypering, sanger, Whole genoom/exoom sequencing
RNA: RT qPCR, RNA sequencing
Eiwit: ELISA, Western blot, op/in cellen: flowcytometrie
Hoe is de opbouw van eiwitten niveau’s?
- Primair: keten van ammunozuren
- Secundair: a-helix, b-sheet,waterstofbruggen
- Tertiar: 3D bouw (hydrofobe interacties, ionaire bindingen, zwavelbruggen)
Wat zijn de functies van eiwitten?
Functies eiwitten: bouwstoffen, enzymen en signaalstoffen (cytokines)
Wat zijn cytokines en wanneer wil je ze meten?
Cytokines:
- Peptides (5-20 kDa)
- Zorgen voor Cell signaling, Effect via receptoren -> activatie van cellen
- Immuunmodulerende werking: pro-inflammatoir en/of anti-inflammatoir
- Ook bekend als: interleukines (IL), chemokines, Interferonen (IFN), tumor necrosis factors (TNF)
Wanneer Cytokines meten:
- Is er ontsteking?
- Welke immuunprocessen zijn actief? Type ontsteking?
- Kun je deze processen beïnvloeden?
- Waarin meten:
○ Pt/ gezonden: bloed, serum, plasma
○ In vitro experimenten: kweekmedium
○ Weefsel: bv huid, synovium samples, muizenmateriaal
Wat zijn PBMCs? En hoe gebruik je ze bij ELISA?
peripheral Blood Mononuclear Cells (geen granulocyten, geen rode bloedcellen) -> alleen witte bloedcellen (T-cel, B-cel, monocyten, NK cellen)
Hier zitten dus ook T cellen in -> je kan deze scheiden in CD4 en CD8 op basis van de oppervlakte markers. Daarna in een aCD3/aCD28 medium -> dit zorgt voor de co-stimulatoire route en survival bij de T-cel activatie -> je kan dan kijken welke cytokines worden gemaakt (na 72 uur)
Bij ELISA: je haalt het medium van de cellen af (die je hebt gekweekt in de vorige stap)
- Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
- Meten van eiwit concentraties
Wat zijn de principes van ELISA?
Principes ELISA:
- Binding van eiwit aan specifiek antilichaam
Gekoppeld aan een enzym (enzym met substraat) dat een kleurverandering veroorzaakt
Hoe gaat de ELISA protocol?
1 Coat: capture antilichaam
2 Block: aspecifieke bindingsplaatsen (zodat er geen aspecifieke reactie komt)
3 toevoegen sample
4 detectie: antilichaam met enzym (HRP)
5 toevoegen substraat (TMB)
6 Enzym reactie geeft een kleur, hoe hoger de enzym concentratie. Hoe intenser de kleur (Te zien op spectrometrie)
Hoe weten we nu wat de concentratie van het eiwit (cytokine) is?
je maakt een verdunningsreeks met bekende concentraties (ijklijn), je kan je meetpunten op de ijklijn zetten. (blanco meting: achtergrond)
- De sample concentraties moeten dan binnen de ijklijn vallen
- Als je boven de ijklijn valt zet je een verdunningsreeks in om deze te bekijken -> je kan dan via de verdunningsfactor de concentratie berekenen
Wat is een verschil tussen flowcytometrie en ELISA?
Flowcytometrie: zegt wat over eiwit secretie in kweek/bloed
ELISA: zegt wat over de frequentie (intracellulaire staining)
Met flow cytometry bepaal je welk celtype positief is (intracellulaire aankleuring) voor de aanmaak van het cytokine van interesse
Met een ELISA weet je niet welk celtype het cytokine produceert binnen de SFMCs maar meet je wel exact de hoeveelheid die is gemaakt en uitgescheiden in het supernatant
Hoe werkt een western blot?
- Scheiden van eiwitten op basis van grootte met gelelektro forese (cel lysaat, dus cellen kapot maken)
- Binding van eiwit aan een specifiek antilichaam met marker
Stappen:
1 gelelektroforese (lading afhankelijk van massa -> scheiding van lijnen, klein gaat snel, groot gaat langzaam, moleculaire ladder/ molladder)
2 transfer naar membraan (nitrocellulose/polyninylidene difluoride (PVDF)) van eiwit wat in de gel zit (je snijd een stuk uit de gel van interesse) -> blotten
3 blokken (voorkomend aspecifieke antilichaam binding, primair antilichaam bindt aan eiwit)
4 detectie met antilichamen (primair antilichaam bindt aan eiwit, secundair antilichaam met HRP enzym bindt aan primaire antilichaam)
Wat zijn de stappen van een westernblot?
Stappen western blot:
1 gel maken
2 sample prepareren (cellen kapot maken: werken met cel lysadfen)
buffer met SDS -> lading
Verhitting: denaturatie: primaire eiwitstructuur
3 gelelektroforese
4 elektroblotten op membraan
5 blokken
6 detectie: primair en secundair antilichaam
7 detectie: luminescentie
Hoe gaat het uitlezen van een Western blot?
Enzym gebonden aan antilichaam aan het eiwit
Toevoegen buffer met substraat -> Reactie geeft licht
* Foto maken van membraan
Wat zijn de verschillen tussen westernblot en ELISA?
Western blot: aanwezigheid eiwit, informatie over moleculair gewicht en afbraakproduct
Antilichaam met epitoop binnenin eiwitstructuur bruikaar, eiwitten meten in cellysaat
ELISA: Meten aanwezigheid eiwit, kwantificeren concentratie eiwit, betrouwbare commerciele kits verkrijgbaar, tijd en arbeid
