Laboratorium technieken: Cellen Flashcards
Introductie tot flowcytometrie
Wat is flowcytometrie?
- Een core techniek binnen de immunologie
- Flowcytometrie: stroom/flow, cel, meten
Een techniek om te identificeren en kwantificeren van cellen in lichaamsmateriaal.
- Flowcytometrie: stroom/flow, cel, meten
Wat zijn de voordelen van een microscoop?
- Je kan de exacte locatie van het signaal (cel) laten zien. Dit heet in situ
- Mooie plaatjes
- Relatief goedkoop
Wat zijn de voordelen van FACS?
- Goed kwantificeerbaar
- In korte tijd veel cellen meetbaar
- Mogelijkheid om de cellen voor andere doeleinden te gebruiken (celkweek)
- Minder hoofdpijn
Een groot voor deel van de FACS is dat er naar de eigenschappen van een enkele cel gekeken kan worden
Wat zijn de onderdelen van een FACS?
- Fluidics: vloeistof systeem
- Optics: optisch systeem
- Elektronica
- Fluidics: Vloeistof systeem van de FACS dat zorgt dat het te analyseren monster van de sample tube naar de flow cel wordt getransporteerd
- Optics: genereert en verzamelt de licht signalen
- Elektronica: zet het optische signaal om in een digitaal signaal
Wat zijn Side en Forward scatter die te zien zijn op een plot na FACS analyse?
Side scatter (SCC): verteld ons iets over de granulariteit van de cel
Forward scatter (FSC): zegt iets over de grootte van een cel
Wat kan je met een FSC-SSC plot?
Met een FSC-SSC plot kunnen we voorspellen waar bv lymfocyten en granulocyten op een plot komen
- Lymfocyten: kleine FSC want ze zijn klein, kleine SCC want ze hebben weinig granula
- De dode cellen komen in het hoekje
Wat zijn CD markers?
- CD staat voor Cluster of Differentiation
- Oppervlaktemarker
- Met behulp van samenstelling van de CD markers kan je bepalen wat voor cel het is
- Bv CD 3= T-cel
Wat is belangrijk bij het uitvoeren van een FACS?
We willen de cellen een voor een meten, hiervoor hebben we een single cel suspensie nodig.
Wat kan je met een FICOL oplossing doen?
Met FICOL oplossing specifiek lymfocyten verkrijgen uit bloed:
- FICOL doe je in buis, hier boven op leg je voorzichtig het verdunde bloed -> er mag nog geen bloed door de ficol heen gaan want dat ben je kwijt
- Daarna ga je centrifugeren zodat de rode bloedcellen naar beneden zakken en daarna de ficol met de witte-bloedcellen en de verdunning bovenop. -> je kan dit gebruiken voor analyse
Wat is een antilichaam?
- Eiwitten die als reactie op een bepaalde oppervlakte marker door ons lichaam worden geproduceerd
- Specifiek
- Sleutel slot
- Wij gebruiken deze antilichamen om oppervlakte markers aan te tonen
Welke soorten oppervlakte kleuring zijn er voor FACS cellen?
- Indirecte of directe labeling
- Bij directe labeling is het antilichaam geconjugeerd met het fluorochroom
- Bij indirecte labeling wordt er nog een 2e labeling gedaan met een geconjugeerd secundair antilichaam
Hoe pas je intracellulaire kleuring op cellen toe bij FACS?
- Als je ook in de cel wilt kijken heb je nog extra technieken nodig
4 stappen van intracellulaire kleuring:
1. Stimuleren met stimulatiestof: je wilt de eiwitsecretie (cytokines) stoppen/blokkeren (met golgi stop) -> zodat eiwitten in de cel blijven
2. Fixeren en permeabiliseren: zorgen dat antigenen/antilichamen op oppervlak blijven en het celmembraan toelaatbaar maken voor antilichamen
3. Labeling: labeling van intracellulaire cytokines of transcriptiefactoren, na labeling cellen wassen zodat het overmaat aan antilichamen uit de cel kan
4. Meten
Waarom gebruik je een Levend/Dood marker op je cellen die je gaat analyseren met FACS?
- Dode cellen willen we niet in de analyse -> want ze kunnen veel onspecifieke dingen labelen, dit is niet representatief
- De levend/ dood markers: kleuren meestal aan op DNA in de cel (mogelijk door permeabele celmembraan bij dode cel)
Wat is een excitatie spectrum?
- Excitatie spectrum is een reeks golflengten die door het fluorochroom worden geabsorbeerd
- Elk fluorochroom heeft een eigen emissie spectrum op een golflengte
Waar hou je rekening mee bij een FACS Panel opzetten?
- Uitgangsmateriaal: PBMC of vol bloed, of iets anders
- Welke cellen hebben je interesse?
- Alleen oppervlakte of ook intracellulaire kleuring
- Affiniteit van antilichaam
- Levend/ dood marker (neem je hem wel of niet mee?)
- Fluorochromen niet in het zelfde detectie kanaal (emissie spectrum)
- Fluorochromen verschillen in eigenschappen (bv; stabiliteit van een fluorochroom, verschil in breedte emissie spectrum)
