CM9 - Bases moléculaires Flashcards
Structure du génome humain
3 millions paires de bases (A, C, T, G)
- 23 paires de chromosomes
Exome environ 1.2%
- Régions codantes: 20 000 gènes
Qu’en est-il du reste?
- Poubelle (« junk DNA ») ?
- Quantité d’éléments régulateurs
Qu’est-ce qu’un gène?
Un gène est une unité de transmission génétique
Contient l’information pour:
- Polypeptide (protéine)
- Molécule ARN fonctionnelle (miARN, ARNr, ARNt)
(upstream) 5’ - promoteur - gene - 3’ (downstream)
Quels sont les types de variations dans les gènes?
- Polymorphismes
- Variations retrouvées dans >1% population (donc bcp plus frequent que mutations)
- Ne cause généralement pas de maladie - Mutations
- Cause de maladie (cancer et autres)
- Mutations germinales
(i) Présentes dans toutes les cellules
(ii) Souvent héritées mais peuvent survenir de novo - Mutations somatiques
(i) Présentes seulement dans quelques cellules différenciées
(ii) Pas de transmission héréditaire
- Polymorphismes
La plupart des gènes ont des petites différences de séquence entre les individus: les polymorphismes.
Les différentes formes de gènes sont appelés allèles.
Permet une diversité génétique dans une population
Ne cause généralement pas de maladie
SNP = single nucleotide polymorphism
Quelles sont les mutations a petite echelle? et donne un exemple
- Mutation ponctuelle (SNV - single nucleotide variant)
Exemple: KRAS – Cancer colorectal - insertion/deletion (indel) (entre 1 a 50 nucleotides)
Exemple: EGFR del exon 19 – Cancer poumon
Quelles sont les types de mutations ponctuelles?
- silent (reste le meme aa)
- nonsens (change aa pour un STOP)
- missense (“faux sens”)
i) conservatrice - change aa pour autre aa avec structure chimique similaire
ii) non-conservatrice - change aa pour autre aa completement different - frame shift (“Mutations de décalage du cadre de lecture)
Quelles sont les types de mutations a grande echelle? et donne un exemple
Deletion - Perte d’un gène en entier ex: gènes supresseurs de tumeur (ex: RB – Rétinoblastome) -> besoin d’un double hit
CNV
Amplification - donne des petits morceaux extrachromosomiques = homogenic staining regions ou «doubles minutes”
Exemple: HER2 (ERBB2) – Cancer du sein
Réarangement (fusion/ translocation) - Peut créer une protéine chimérique ou les translocations peuvent aussi activer des gènes ex: translocaton près d’un nouveau promoteur très actif
Exemple: t(11;22) EWS/FLI1 - Sarcome d’Ewing
Autres types lésions génétiques
Aneuploidie
microARN
- Régulation expression proto-oncogènes et gènes suppresseurs
Modifications épigénétiques
- Méthylation ADN : inhiber gènes suppresseurs tumeurs et réparation ADN
- Histones
Qu’est-ce qu’un biomarqueur?
caractéristique qui est mesurée et évaluée de manière objective comme indicateur de processus biologiques normaux, de processus pathogènes ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique
Quels sont les types de biomarqueurs?
Biomarqueur de prédisposition
- Identification des individus à risque de développer une maladie
Biomarqueur diagnostic
- Détection de la maladie
Biomarqueur pronostic
- Information sur le pronostic et risque de récidive
Biomarqueur prédictif
- Prédiction sur la réponse au traitement
Un gene est quel type de biomarqueur?
Gènes = biomarqueurs oncologiques
Donne un exemple de Biomarqueur de prédisposition
BRCA1, BRCA2: Cancer sein et ovaires
Donne un exemple de Biomarqueur diagnostic
BCR-ABL : LMC
Donne un exemple de Biomarqueur pronostic
ER, PR : Bon pronostic cancer du sein
Donne un exemple de Biomarqueur prédictif
HER2 : Cancer sein
Mutations : Conducteurs vs Passagers
Mutations conducteurs («Driver mutations»)
- Mutations dans gènes de cancer
- Contribuent DIRECTEMENT au développement ou progression cancer
Mutations passagers («Passenger mutations»)
- Mutations dans gènes autres
- Généralement silencieuses/neutres, mais…
- Retrouvées grande quantité cancers exposition carcinogène
Hybridation in situ (ISH)
Technique d’hybridation sur des chromosomes de sondes d’ADN complémentaires
Visualisation par
- Microscopie à fluorescence (FISH)
But : détecter un défaut génétique (mutation) de grande traille
- Amplification (Donc peut detecter HER2 par FISH car amplification)
- Délétion
- Translocation
Sondes FISH
Courte séquence d’ADN/ARN (200-1000 kb)
Spécifique à la cible souhaitée
Marqué avec fluorochrome (rouge, vert, orange, jaune, …)
- Gene-specific probe
- centromeric-specific probe
- telomeric probe
- chromosome-painting probe
A la lecture, regarde:
- Présence/absence signal cible (quantité)
- Distribution spatiale (localisation)
- si a eu translocation peut avoir nouvelle couleur (jaune - a cause melange rouge et vert)
1. Sondes de séparation (break-apart)
2. Sondes de fusion
Quel est le rôle du gène HER2 dans le cancer du sein ?
Récepteur facteur de croissance – proto-oncogene
son expression peut etre tres amplifiee –> entraine proliferation
Oncogènes
Proto-oncogènes: gènes cellulaires normaux impliqués dans la croissance et prolifération cellulaire
Oncogènes: version mutée ou surexprimée d’un proto-oncogène
i) Mutation activatrice (“gain-of-function”)
– Activation “constitutive” (i.e. en tout temps) indépendante
ii) Effet dominant dans la cellule
Fonction des oncogènes (5) et donne des exemples
Facteurs de croissance (PDGF)
Récepteurs pour facteurs de croissance (EGFR, HER2/neu)
Transducteurs de signaux (RAS, RAF)
Facteurs transcription nucléaire (MYC)
Régulateurs cycle cellulaire (Cyclines et CDK)
Mécanismes d’activation des oncogènes
Êtes-vous capable de nommer une exemple d’oncogène par mécanisme et le cancer associé?
Est-ce que la mutation/activation seule d’oncogènes est suffisant pour causer une prolifération cellulaire incontrôlée?
Mutation ponctuelle
- Ex: RAS – cancer colon
Amplification génique
- Ex: HER2 – cancer sein
Translocation
- Ex: MYC – lymphome de Burkitt
Surexpression (boucle autocrine)
- Ex: glioblastome (glioblastome(GBM) avecamplificationdu récepteur du facteur de croissance épidermique (R-EGF/EGFR))
Est-ce que la mutation/activation seule d’oncogènes est suffisant pour causer une prolifération cellulaire incontrôlée?
Non (faut autres mutations ex dans genes controlant apoptose, supresseur de tumeur, etc.)
Cancers héréditaires
Prédisposition au cancer qui est héritée
Environ ____% des cancers
Sous influence de facteurs _________
Prédisposition au cancer qui est héritée
Environ 5-10% des cancers
Sous influence de facteurs environnementaux
Mutations germinales vs somatiques
Mutations héréditaires (germinales)
- Présent dans ovaire ou spermatozoïde Héréditaire
- Toutes les cellules affectées
Mutations acquises (somatiques)
- Présent dans tissu non-germinal
- Non-héréditaire
- Mutation présente seulement dans tumeur
Quelles 2 fonctions prédominent dans ces gènes de cancer familiaux?
Nommes en qq un
Gènes suppresseurs de tumeur (+ de reparation de l’ADN)
Rb - retinoblastome TP53 - Li-fraumeni syndrome APC - FAP/cancer du colon BRCA1-2 - Cancer du sein et des ovaires Hereditary nonpolyposis colon cancer Xeroderma pigmentosum
Gènes suppresseurs de tumeurs
Agissent comme freins à la prolifération cellulaire
Mode d’action RECESSIF à l’échelon cellulaire (2 copies du genes doivent etre mutees pour que l effet se fasse sentir)
- Type « gouverneur »
- Type « gardien »
- Prototypes: RB, TP53
Hypothèse de Knudson (1974) concernant un cancer retinoblastome
Deux événements génétiques (mutations) requis pour inactiver le gène RB (« two-hit hypothesis »)
Distingue les formes sporadique et familiale du rétinoblastome
Gène RB
Gène « gouverneur » (Sens et integre tous les stresseurs externes pour decider si la cellule peut, oui ou non, continuer son cycle cellulaire)
Perte de fonction retrouvée dans plusieurs cancers
- gène RB directement ou
- autres gènes dans voie signalisation (p16, CDK4, cyclin D)
Fonction principale
- Frein à la croissance cellulaire
- Contrôle transition G1-S cycle cellulaire
sequestration de E2F sous sa forme hypophosphorylee - active des histones qui vont inhiber la progression du cycle cellulaire
TP53
« Gardien » du génome
Gène le plus fréquemment muté dans les cancers humains
- 70% des cancers mutation TP53
- Mutations gènes liés au TP53 (MDM2)
Activation par stresseurs internes
- Arrêt phase G1 (quiescence) et activation réparation ADN
- Sénescence, apoptose
Autres gènes suppresseurs…
TGF-B
Inhibition contact (E-cadérine, APC, B-caténine WNT)
Cancer du sein héréditaire
- Environ ___% de tous les cancers du sein
- Lesquels sont a haut risque?
- Lesquels sont a risque modere/faible?
Environ 5% de tous les cancers du sein
Gènes à haut risque
- BRCA 1 et 2
- TP53 (Li-Fraumeni)
- PTEN (Cowden)
Gènes à risque modéré/faible
- CHEK2
- ATM
- PALB2
BRCA 1 et 2
Gènes de réparation de l’ADN (recombinaison homologue)
Mutation germinale fortement associée au cancer du sein précoce
Risque à vie 50-85%
Autres cancers associés
- BRCA1 : ovaires, prostate
- BRCA2 : ovaires, pancréas, prostate, …
(BRCA pour Breast CAncer)
Mécanismes de réparation de l’ADN (3)
Trois système de réparation de l’ADN, selon type de mutations/altérations:
- Mésappariement (« mismatch repair »)
- Excision (« nucleotide excision repair »)
- Recombinaison (« recombination repair »)
Mode d’action récessif
Mutations héréditaires dans certains syndromes familiaux de cancer
Pouvez-vous donner un exemple de cancer pour “Mésappariement (« mismatch repair »)”?
Syndrome de Lynch – MSH1, MSH2, MLH1
Pouvez-vous donner un exemple de cancer pour “Excision (« nucleotide excision repair »)”?
Xeroderma pigmentosum
Pouvez-vous donner un exemple de cancer pour “Recombinaison (« recombination repair »”?
Cancer du sein - BRCA1 et 2
Comment détecter les mutations: Sources possibles d’ADN?
Laquelle utilise-t-on pour BRCA1 et2?
Sang (celui qu’on utilise pour BRCA1 et 2)
Tissu frais
Tissu congelé
Frottis cytologiques
Tissu paraffiné
– Blocs cellulaires
Différentes méthodes de détection des mutations (3)
Séquençage Sanger
PCR
Séquençage de nouvelle génération (NGS)
Photos de coupes histologiques de lymphome de Burkitt
Ce tissu lymphoide est normal ou anormal?
Quelle cellules distinguez-vous?
Que voyez-vous d’autres? Que cela signifie-t-il?
anormal
Lymphocytes + mitoses + corps apoptotiques - tumeur prolifere rapidement
Lymphome de Burkitt = poliferation TRES rapide
Métabolisme cellulaire
La plupart des tumeurs ont un métabolisme cellulaire très élevé.
Quelle est la façon la plus efficace de générer de l’énergie (ATP) ?
Phosphorylation oxidative? 36 ATP/glucose
Glycolyse? 2 ATP/glucose
Qu’est ce que les tumeurs utilisent comme metabolisme? dans quel but?
Glycolyse AÉROBIQUE : forme de métabolisme favorisant la glycolyse par rapport à la phosphorylation oxidative
But: générer des métabolites (précurseurs) pour la synthèse de composantes cellulaires (ADN, ARN, protéines, lipides, etc…)
= Effet Warburg
Effet Warburg
- Favorisé par :
- Opposé par:
Favorisé par : proto-oncogènes (RAS, MYC, récepteurs facteurs croissance)
Opposé par: gènes suppresseurs de tumeurs (PTEN, TP53)
Lymphome de Burkitt
- quelles sont les 2 variantes et leur similitudes/différences?
Deux variantes:
- Endémique (africaine)
- Sporadique
Similitudes:
- Histologie et altérations moléculaires
Différences:
- Présentation clinique et virologique
(Forme endemique: VIRUS EBV est impliqué - Virus EBV reste à l’interieur des lympho B – infection latente)
Lymphome de Burkitt
- quelle est la methode d activation?
Méthode d’activation oncogène MYC
(Proto – oncogene : facteur de translation)
Transloqué au niveau du promoteur des IGH, cause une surexpression de la protéine MYC
Par quels tests peu-on detecter une t(8;14) comme dans un lymphome de Burkitt?
Test FISH
- si translocation : point jaune au lieu de seulement verts et rouges
PCR (polymerase chain reaction)
- Technique d’amplification exponentielle ADN cible
- Amorce specifique a un gene et fait des amplifications
Analyse de biomarqueurs moléculaires -> PCR temps reel apres microdissection et extraction de l’ADN
- Du tissu… au séquençage
PCR transciptase inverse (ARNm)
- Amorces qui vont un peu se chevaucher au niveau de la cassure entre genes IgH et MYC (qui vont dans 2 directions oposées si a eu translocation) – si a pas de translocation, va juste continuer le long du gene IgH ou encore de MYC
Translocation 14;18
Quel est votre diagnostic?
Lymphome folliculaire
- Translocation BCL2
Lymphome folliculaire
Translocation?
Juxtapose quoi?
Résultat :
Translocation (14;18) dans le lymphome folliculaire
Juxtapose le promoteur des immunoglobulines (IgH) à BCL-2.
Résultat : surexpression de la protéine anti-apoptique.
Cancer et apoptose
comment evite?
Altérations gènes apoptose = Évasion de la mort cellulaire
Interférence avec voie intrinsèque (mitochondriale)
- Inactivation gènes pro-apoptotiques (TP53 et gènes connexes)
- Surexpression gènes anti-apoptotiques (BCL2)
Agents carcinogènes infectieux et leur mecanismes d action
Types d’agents infectieux
- Virus ARN oncogènes (HTLV-1)
- Virus ADN oncogène (HPV, EBV, HHV-8, HBV)
- Helicobacter pylori
Mécanismes d’action
- Protéines virales oncogéniques
- Inflammation chronique
- Intégration virale génome cellule
VPH
Oncoprotéines virales E6 et E7
- roles?
- Y-a-t-il une différence entre les protéines E6 et E7 des virus HPV de bas risque (types 6,11) et de haut risque (types 16, 18)?
HPV E6 :
- augmentation de l’expression de la telomerase
- inhibition de p53
HPV E7:
- inhibition de p21 -> entraine augmentation de CDK4/cycline D -> inhibition de Rb-E2F
- inhibition de Rb-E2F (directement?)
E6 et E7 des virus a haut risque se lient bcp plus facilement/fortement à p53
Nomme un marqueur specifique au cancer colorectal donc on sait que c’est une métastase dans le ganglion si la l’analyse histologique du ganglion montre ce marqueur
CDX-2
Réaction IHC pour le VEGF
Qu’est-ce que le VEGF?
Par quelles cellules est-il produit?
Qu’elle est l’implication de l’angiogenèse pour la formation des métastases?
Qu’est-ce que le VEGF?
- Facteur de croissance
Par quelles cellules est-il produit?
- Stromales, tumorale, presque toutes
Qu’elle est l’implication de l’angiogenèse pour la formation des métastases?
- Croissance des vaisseaux – plus de vaisseaux plus metastases peuvent se propager
Carcinome colorectal métastatique
- compte pour ~___% des nouveaux patients
- comment est le prognostic?
Carcinome colorectal (CCR) métastatique compte pour ~10% des nouveaux patients
Malgré plusieurs avancées dans le traitement, le survie médiane demeure faible (18-21 mois)
Carcinome colorectal métastatique
- mutation?
Voie de signalisation EGFR
- growth factors ex: EGF stimulent recepteur EGFR -> voie de signalisation RAS -> proliferation
- essaye des medicaments pour cibler et inactiver recepteur EGFR mais pourtant ca ne marche pas car mutation RAS en aval qui est deja activé de facon constitutive donc medicament aura aucun effet
= Mutations RAS confiant une résistance au traitement anti-EGFR - KRAS et NRAS
Comment détecter les mutations RAS?
Sources possibles d’ADN: Sang Tissu frais Tissu congelé Frottis cytologiques Tissu paraffiné – Blocs cellulaires
Pour ce patient:
Pas le sang car surtout des mutations somatiques et non germinale
Analyse de biomarqueurs moléculaires
- Du tissu… au séquençage (microdissection puis extraction ADN puis Séquençage de nouvelle génération (NGS) (genes multiples) ou PCR temps reel (gene unique))
= Donc prend surtout des blocs de paraffine
NGS: Définitions
Séquençage génome complet (Whole Genome Sequencing)
- avantages et inconvenients
Avantages: Non-biaisée, détecte toutes mutations
Inconvénients: Coûts, sensibilité limitée
NGS: Définitions
Séquençage exome complet (Whole Exome Sequencing)
- avantages et inconvenients
Avantages: Détecte tous SNV, CNV
Inconvénients: Coûts, sensibilité limitée, pas de fusion
NGS: Définitions
Séquençage ciblée (Targeted Sequencing)
- avantages et inconvenients
Panel de gènes d’intérêt (10-400 gènes)
Avantages: Coûts, rapide, sensibilité
Inconvénients: Biais gènes ciblées
Panel de gènes de « cancer »
Illumina TruSight Tumor 15 (TST15) panel
Plusieurs gènes peuvent être séquencés en même temps sur un même échantillon (même tube)
250 amplicons, couvrant 810 hotspots sur 15 gènes de « cancer »
Cancer et immunité
Tumeurs sont reconnues comme « non-soi » et élicitent une réponse immunitaire T- dépendant (surveillance immune)
- Néo-antigènes (mutations « passagers »)
- Protéines rares/peu exprimées de façon normale
- Protéines virales oncogènes
Mécanismes d’évasion du système immunitaire
- Sélection sous-clones peu immunogènes
- Réduction expression CMH classe I
- Immunosuppression par protéines inhibitrices (« checkpoint inhibitors »)
