מולקולרית פרק 8 - שיטות מחקר

Question 1

למה משמש EDTA?

Answer 1

קושר סידן וכך עוזר לנתק צמתים של קישור למטריקס החוץ תאי

Question 2

Fluorescence activated cell sorter
למה משמש?
מהם השלבים ורכיבי המפתח?

Answer 2

משמשת להפרדה בין תאים.
בשלב הראשון מצמידים לתאי המטרה נוגדן פלוריסנטי.
אז התאים עוברים דרך צינורית מיוחדת שמייצרת טיפות שמכילות תא אחד בלבד.
אז קרן לייזר מפעילה את הפלוריסנציה, אם יש.
תאים עם פלוריסנציה מקבלים מטען שלילי.
אז עוברים דרך קבל, וההפרדה מתבצעת על סמך מטען.

Question 3

למה משמש פוליליזין?

Answer 3

מטריקס חלופי אליו תאים שזקוקים לכך, יכולים להיצמד בתרבית.

Question 4

מהי תרבית ראשונית?

Answer 4

• תרבית שהוכנה ישירות מרקמה של אורגניזם

Question 5

מהי תרבית שניונית?

Answer 5

כל תרבית שנוצרת מתרבית אחרת ולא ישירות מאורגניזם.

Question 6

תרביות תאים

Answer 6

מייצרות אוכלוסיית תאים הומוגנית

שומרים על התכונות – פיברובלסטים מפרישים קולגן, תאי שריר מתכווצים ספונטנית, ניתן לעורר תאי עצב והם מייצרים סינפסות.

Question 7

מהי
• Callus Culture?
ומהו קאלוס?

מה פותר אורז זהב?;

Answer 7

תרבית מצמח ממנה ניתן לייצר צמח שלם.

חלוקה של תאים במבנה לא מאורגן ויחסית לא ממויינים.
שממנה אפשר ליצור במקרים מסוימים צמח שלם.

A מחסור בויטמין
זהו אורז טרנסגני מיוחד שמכיל את הויטמין הנל.

Question 8

מהי

replicative cell senescence?

Answer 8

תאים בתרבית מפסיקים להתחלק, לאחר כ-25-40 חלוקות בשל התקצרות הטלומרים והפסקת הפעילות של האנזים טלומראז.

ניתן להתגבר עי החדרה של טלומראז

תאים של עכברים לא מכבים את הטלומראז.

Question 9

מהי תופעת

culture shock?

Answer 9

מנגנון לא ידוע שגורם לתאים בתרבית להפסיק להתחלק, למרות שהטלומראז שלהם עדיין פעיל.

כאן טלומראז לא יעזור, כדי להפוך את התאים לאימורטליים יש להפוך אותם לתאים סרטניים. כלומר, תאים בעלי יכולת לעקוף את מנגנון העצירה ולהמשיך להתחלק.

Question 10

מהם

transformed cell lines?

Answer 10

שושלות תאים שעברו התמרה סרטנית,

כך שהם לא צריכים מטריקס להיצמד אליה בתרבית,
ומתחלקים באופן צפוף יותר

Question 11

במה מאפשר לצפות תא

PtK

Answer 11

זהו תא אפיתל של קנגורו הנשאר שטוח בזמן מיוזה ומאפשר לצפות בתהליך.

Question 12

כיצד ניתן לייצר נוגדנים הטרוגניים?

וכיצד מונוקלונאליים?

Answer 12

בהזרקת האנטיגן לחיה ובידוד הנוגדנים יתקבלו באופן טבעי הטרוגניים.

אפשר לייצר נוגדנים מונוקלונאליים בעזרת היברידומה,
שהיא בעצם הכלאה בין תא מייצר נוגדנים לבין תא אימורטלי.

Question 13

כיצד ניתן לאתר חלבון נדיר בתערובת?

Answer 13

עי יצירת נוגדן ספציפי לחלבון זה.

Question 14

מהו הטרוקריון?

Answer 14

תא המכיל שני גרעינים שונים, למשל בשלב מקדים לייצור היברידומה.

כאשר בהיברידומה עצמה הגרעינים עברו איחוי; עי חלוקה - הרס הגרעין במיטוזה ואיחוי מחדש של שני הגרעינים כגרעין אחד.
מגדלים את התאים על תרבית סלקטיבית שתאפשר רק לכאלו שעברו איחוי לשרוד.

Question 15

מהם מיקרוזומים?

Answer 15

איחוי ספונטני של שברי ממברנה לאחר שבירה של תא.

Question 16

מה מכיל מכשיר צנטריפוגה?

Answer 16

מנוע רוטור
תא מבודד
מערכת קירור שומרת על טמפ’ של 4 מעלות
חלל ריק, ואקום - הסיבוב נעשה בוואקום שמפחית חיכוך ומונע חימום

Question 17

מה שונה בצנטריפוגה מסוג

swing bucket rotor?

Answer 17

המבחנות ב-90 מעלות, באופן אופקי, ההפרדה בתחתית ולא בצדדים.

Question 18

VELOCITY SEDIMENTATION

Answer 18

הדגימה מוכנסת מלמעלה, בראש המבחנה ונעה כלפי מטה על גרדיאנט סוכרוז מתון, בריכוז נמוך

הפרדה על פי גודל וצורה.
כלומר, השיטה לא תהיה יעילה לשני חלבונים באותו הגודל.

Question 19

EQUILIBRIUM SEDIMENTATION

Answer 19

הדגימה בכל מקום, נעה למטה או למעלה, אי אפשר לדעת מראש.
גרדיאנט הסוכרוז חד, והריכוז בין 20-70%
רכיבים בעלי צפיפות נמוכה למעלה וגבוה למטה

שיטה סופר רגישה, יכולה להבדיל בין איזוטופים.

הפרדה עפ צפיפות ציפה
buoyant density.

בגדול, ההפרדה היא על פי צפיפות.
שני חלבונים עם אותה צפיפות - יחס מסה נפח - לא יופרדו.

Question 20

אילו מולקולות יצאו קודם בכרומטוגרפיית ג’ל פילטרציה?

Answer 20

מולקולות גדולות יצאו קודם, משום שהם גדולות מדי בכדי להיכנס לחריצי המטריקס ופשוט עוברות מסביב.

Question 21

מה אפשר לשים בכרומטוגרפיית אפיניות?

Answer 21

נוגדן לחלבון
סוב’ לאנזים
דנא לחלבון קושר דנא

Question 22

למה משמשת

HPLC – high performance liquid chromatography?

Answer 22

מגבירה את רזולוציית ההפרדה במעבר דרך הקולונה.

Question 23

מהי אימונופרסיפציה ולמה היא משמשת?

Answer 23

שיטה מהירה להפרדה וטיהור חלבונים.
חרוזי האפיניות מוכנסים למבחנה עם החלבון, ואז עושים צנטריפוגה.
כלומר אין שלב של מעבר דרך קולונה

Question 24

טאגים מולקולריים מספקים?

Answer 24

דרך פשוטה לטיהור חלבונים
לעיתים קרובות הטאג הוא דטרמיננטה אנטיגנית, או אפיטופ, שמזוהה ע”י נוגדן. סוגים אחרים של טאגים עוצבו במיוחד לטיהור חלבונים ע”י כרומטוגרפיית אפיניות או אימונופרספירציה. למשל רצף היסטידין שנקשר ליון מתכת.

לעיתים יכול להיות חלבון שלם כטאג, למשל גלוטטיון טרנספראז או אפילו ביקוע.

Question 25

מהי

TAP-tagging – tandem purification tagging?

Answer 25

שיטה לטיהור חלבונים בה מהנדסים חלבון עם שני טאגים.
הראשון נצמד לקולונה ונחתך עי פרוטאזה,
הטג השני משמש כרמת זיהוי נוסף,
ומתקבלת שיטה עם יכולת הפרדה גבוהה.

Question 26

למה משמש ביתא-מרקפטואתנול ?

Answer 26

חומר מחזר, לפתיחת קשרי

S-S

Question 27

SDS הוא?

Answer 27

דטרגנט הידרופובי בעל שרשרת אצילית ארוכה
כל מולקולת חלבון קושרת מס’ גדול של מולקולות דטרגנט שליליות, שממסכות על המטען של החלבון וגורמות לו לנוע לעבור האלקטרודה החיובית
הורס את המבנה הנטיבי ומשחרר אינטראקציות חלבון-חלבון הידרופוביות

Question 28

שיטת

SDS-PAGE

Answer 28

שיטה להפרדת חלבונים על בסיס גודל.
יתרונה בכך שבאמצעות ה-
SDS
אפשר להפוך כל חלבון למסיס ולפיכך להפרידו, גם חלבון ממברנלי.

ניתן להסיק משקל מולקולרי וכן מהן וכמה תתי יחידות לחלבון.

Question 29

מה מספק ג’ל אלקטרופורזה דו ממדית ,

וממה הוא מורכב?

Answer 29

מספק יכולת הפרדה טובה יותר.
יש לו שני שלבים, בשלב הראשון פוקוס איזואלקטרי, לאחר מכן הפרדה ב-
SDS-PAGE.
זה מאפשר להפריד בין שני חלבונים באותו גודל
למעשה הרזולוציה שלו ככ טובה שמאפשר להפריד בין שני חלבונים הנבדלים בח.א אחת!

Question 30

למה משמש ווסטרן בלוטינג (אימונובלוטינג)?

Answer 30

בשיטה הזו ניתן לאתר חלבונים באמצעות נוגדן.

Question 31

מה המטרה העיקרית של ספקטרומטריית מסות?
איזו תכונה היא מנצלת?
על סמך מה נעשית ההפרדה?

Answer 31

זיהוי חלבונים לא מוכרים,
מנצלת את העובדה שלחלבונים יש דינמיקה מסוימת בתנועה דרך שדה חשמלי.
ההפרדה נעשית על סמך יחס מסה/מטען

זו טכניקה רגישה במיוחד, שדורשת מעט חומר דגימה, טעות של אחת למיליון.

Question 32

מהם שלושת הרכיבים העיקריים של ספקטרומטר מסות?

Answer 32

שלושה רכיבים עיקריים:
מקור יוני – שממיר כמות קטנה מדגימת הפפטיד וממיר אותה לגז המכיל את הפפטיד. היונים האלו מואצים ע”י שדה חשמלי
אנלייזר מסות, שם משמש שדה מגנטי להפרדת היונים על בסיס היחס מסה/מטען שלהם.
לבסוף, היונים המופרדים מתנגשים בגלאי.

Question 33

מדוע אנזימי רסטריקציה נקראים כך?

Answer 33

משום שהם מגבילים את הכניסה של מולקולות דנא זר לתא החיידק.

Question 34

אנזימי רסטריקציה

Answer 34

• עובדים כדימרים
• מזהים רצף בדנא
• חותכים ישר או קצוות דביקים
  ישר: Haelll
  דביק: EcoRl, HindIII

Question 35

באיזה ג’ל נשתמש כדי להפריד מולקולות דנא קטנות מ-500 ז”ב?

Answer 35

בג’ל פוליאקרילאמיד, שהוא צפוף יותר מהאגרוז, ויכול להפריד עד לרזולוציה של נוקלאוטיד אחד.

Question 36

מהי שיטת

pulse-field gel electrophoresis

Answer 36

שיטה להפרדת מולקולות דנא ארוכות במיוחד.
הפרדה בג’ל עם שדה חשמלי משתנה מיוחד, שמטה את המולקולות כל הזמן, ההטייה מעכבת אותן ביחס ישיר לגודל: גדול = יותר עיכוב
וכך ניתן לבצע הפרדה.

Question 37

באיזו שיטה נשתמש כדי להפריד בין כרומוזומים?

לא יונקיים

Answer 37

pulse-field gel electrophoresis

המיועדת להפרדת מולקולות ארוכות במיוחד.

Question 38

למה משמש אתידיום ברומיד?

Answer 38

צביעת מולקולות דנא בג’ל.

Question 39

למה משמש דיגוקסיג’נין בדנא?

Answer 39

אפשר לחבר אותו לנוקלאוטיד באמצעות ספייסר, כך שלא יפריע לשלד הדנא.
ובעצם לייצר נוקלאוטיד מסומן שיוכנס לשרשרת עי פולימראז.
השיטה מנצלת את העובדה שיש לדיגוקסיג’נין נוגדן מוכר, ומחברים אליו סמן פלוריסנטי.

Question 40

למה מתייחס המונח שיבוט? מהן שתי השיטות העיקריות לשיבוט דנא?

Answer 40

מתייחס להכנת העתקים רבים של מולקולת דנא.
שתי השיטות העיקריות הן שימוש בווקטור או ב
PCR.

Question 41

מה זה

Genetic screen?

Answer 41

חיפוש פעיל אחר מוטנט עם הפנוטיפ המבוקש לאחר השראת מוטגן.

Question 42

מהי מוטציה מותנה?

מתי היא שימושית?

Answer 42

מוטציה שבאה לידי ביטוי רק תחת תנאים מסוימים.
למשל, טמפ’ מסוימת שהורסת את קיפול החלבון.
היא שימושית להשראת מוטציות שאחרת היו לטליות ולא מאפשרות לאורגניזם להתקיים.

Question 43

למה משמש מבחן קומפלמנטריות?

וכיצד הוע נעשהץ

Answer 43

על מנת לקבוע אם פנוטיפ מוטנטי מגיע מגן אחד או שניים.
לוקחים שני פרטים, כל אחד הומוזיגוט למוטציה באחד הגנים אך בעל פנוטיפ תקין, אם הצאצא מוטנטי נאמר שיש קומפלמנטריות - המוטציה משלימה אחת את השנייה

Question 44

Epistasis analysis

Answer 44

משמשת לקביעת סדר ביטוי של גנים במסלול.
למשל, אם מוטציה בגן א מפסיקה את התהליך בשלב הראשון, נדע שגן א פועל לפני גן ב.

שיטה זו שימשה למשל לקביעת סדר מסלול ההפרשה בתא, מוטציה בחלבונים שונים גורמת לאגירה באיברונים שונים.

Question 45

synthetic phenotype

Answer 45

כאשר מוטציה בשני גנים מובילה לפנוטיפ חמור יותר.
תופעה זו יכולה להצביע על כך ששני הגנים פועלים במסלול שונה.

אם מובילה למוותת זה מכונה
synthetic lethality.

Question 46

בלוקים הפלוטיפיים

Answer 46

קומבינציה של פולימורפיזם המורשת יחד כיחידה

Question 47

אילו גורמים משוערים לפולימורפיזם גנטי?

Answer 47

SNP - single nucleotide polymorphism
CNV - copy number variation
indel - insertion deletion

*למרות הרצון הטוב, פולימורפיזם לא ממש מנבא סיכוי מוגבר לחולי, במקרה הטוב רק פי 2, לעומת זאת, וריאציות דנא נדירות נמצאו כקשורות לסיכון מוגבר לאוטיזם וסכיזופרניה

Question 48

SNP

Answer 48

single nucleotide polymorphism
אתרים בגנום בהם שתיים או יותר אלטרנטיבות של נוקלאוטיד נפוצות באוכלוסיייה.
בדרכ במיקום שאינו קריטי לתפקוד הגן

Question 49

reverse genetics

Answer 49

לעומת המחקר הקלאסי שמתחיל ממוטציה והולך אחורה אל הגן.
כאן, החוקר מתחיל מהגן הנחקר ומשרה בו מוטציה על מנת לבחון את ההשפעות התאיות.

שיטה זו מכונה גם
genome engineering or editing.

למשל, אפשר להכניס לאזור הבקרה של גן רצף קישור לרפרסור תלוי סוב’. כאשר הסוב נוכח הרפרסור לא פעיל/פעיל וכך ניתן לשלוט בביטוי הגן.

Question 50

שלבים ליצירת עכבר טרנסגני

Answer 50

מתחילים מתאי גזע עובריים,
מחדירים להם דנא מהונדס ונותנים להם להתחלק
מחפשים את התאים אליהם חדר הדנא הזר
לוקחים עוברה מעכברה ומבודדים אותו
מחדירים לתוכו את התאים הטרנסגניים
מחדירים את העובר הטרנסגני לעכברה בהריון מדומה
העוברים נקלטים ונולדים עכברים הטרוזיגוטיים למוטציה
בהכלאה ביניהם מקבלים עכבר שמבטא רק את הפנוטיפ המוטנטי.

Question 51

trichothiodystrophy

Answer 51

מחלה גנטית נדירה, פגיעה במע’ תיקון דנא
שיער שביר, עיוותים בשלד ותוחלת חיים קצרה מאד.
זה מראה לנו שהצטברות נזק בדא תורמת לתהליך ההזדקנות.

Question 52

מע’ CRISPR

Answer 52

מאפשרת הכוונה של המטוציה למיקום מסוים בעזרת רצף רנא מכווין.
מפשטת את תהליך הכנת עכברים טרנסגנים.
התהליך:
חלבון קאס9 מבוטא בתא גזע עוברי ביחד עם רצף רנא מכווין,
מביאים את הקומלקס לגנום תאום
חלבון קאס מייצר שבר דו גדילי
התא משתמש בגן שעבר שינוי כתבנית לתיקון וכך פגענו במכוון בגן נורמלי והחלפנו בגן שהונדס עי החוקר.

היתרון הגדול של השיטה הוא שהיא מאפשרת לשלוט במיקום המוטציה.

Question 53

מיהו חלבון

Cas9?

Answer 53

חלבון מע' הקריספר החיידקית.
בפעילות הבסיסית שלו יוצר שבר דו גדילי.
אפשר להנדס אותו כך שבמקום שבר יחובר לחלבון אקטיבטור
או רפרסור
וכך לכבות ולהדליק בעזרתו גנים.

Question 54

RNAi
כיצד ניתן להחדיר אותו לתוך נמטודה?
חסרונות שלו

Answer 54

RNA interference
יכול לשמש לפגיעה בגן מסוים, כלומר לשיטה להשראת מוטציה.
צריך להנדס רנא עם הרצף הקומפלמנטרי לגן אותו מעוניינים להשתיק, והוא ייקשר אליו ויפחית את ביטוי הגן.

אפשר להזריק אותו ישירות, או שאפשר להחדיר אותו דרך חיידקי אי קולי שמכילים אותו.

אינו פועל בצורה יעילה על כל הגנים, לפעמים פוגע בגנים אחרים בגלל דמיון ברצף

Question 55

גנים מדווחים

Answer 55

משמשים למחקר דפוס ביטוי של גן.
שמים גן מדווח אחרי רצף בקרה שרוצים לדעת מתי הוא פועל, וכך ניתן להבחין בדפוס הביטוי הגנטי.

שניים נפוצים ביוקריוטיים הם
ביתא גלקטוזידאז ו
GFP

Question 56

in situ hybridization.

Answer 56

מאפשר לאתר את הרנא בתא וכך להסיק אילו
גנים מבוטאים בנק’ זמן מסוימת.
שימושי במיוחד כאשר מדובר בגנים שהתוצר הסופי שלהם הוא רנא ולא חלבון.
להדגיש שזו שיטה לאנליזה של דפוס ביטוי גנים דרך הרנא

חשוב גם להדגיש שמולקולות רנא נדירות יהיו קשות לאיתור

Question 57

quantitative RT-PCR

Answer 57

מתחילים בחילוץ כל הרנא מהתא,
חשוב מאד מאד מאד שלא יהיה בכלל דנא בדגימה וזה דורש הכנה, למשל שימוש בנוקלאז.
מכניסים שני פריימרים דנא שתואמים לרנא הנחקר, ביחד עם ריברס טרנסקריפטאז, דנא פולימראז וארבעת הנוקלאוטידים.
בשלב הראשון נוצר מהרנא דנא.
אחר כך עושים PCR.

החלק הכמותי של השיטה מתייחס לקשר הישיר בין כמות הדנא שיופק לבין כמות הרנא המקורית שהיתה.

Question 58

שיטת

DNA microarray

Answer 58

יתרון - מאפשר לחקור בו זמנית אלפי מולקולות רנא שונות
מחלצים רנא מהתא
ממירים אותו ל
cDNA
שמסומן פלוריסנטית ועושה היברידיזציה לדנא בבאריות.
אז קובעים באמצעות מיקרוסקופ פלוריסנטי אילו באריות מכילות דגימה וניתן להסיק לגבי דפוס ביטוי הגנים בתא בנק’ בה נלקח הרנא.

לשים לב שבבאריות יש דנא!
חיסרון של השיטה הוא שהיא מחייבת לדעת את הרצף שמחפשים מראש כדי להכין גלאי.

Question 59

cluster analysis

Answer 59

ניתן לזהות מערך של גנים שיש להם בקרה מתואמת.

בעצם אפשר באמצעות השיטה הזו לבחון עם אילו גנים אחרים גם מסוים מתבטא, וכך להסיק על התפקיד שלו - של החלבון שהוא מקודד לו.
למשל, חבורה של גנים שמתבטאים בתהליך של ריפוי פצע.

Question 60

מהן שתי השיטות שצויינו לניתוח דפוס ביטוי גנים בנק זמן מסוימת בתא?

Answer 60

מיקרואריי וריצוף של הרנא,

שני אלו יראו אילו גנים מתורגמים ברגע מסוים.

Question 61

שיטת

Chromatin immunoprecipitation

Answer 61

מאפשרת לזהות את כל רצפי הגנום אליהם קשור רגולטור בקרה מסוים ברגע מסוים בתא.
התהליך:
באמצעות פורמאלדהיד מייצרים קשרי צילוב בין דנא לחלבון
עושים ליזיס לתאים
שוברים את הדנא למקטעים של 200
מוסיפים נוגדן ספציפי לרגולטור הבקרה
מסירים את הקשרים, מסירים את החלבון, מרצפים את הדנא

Question 62

שיטת פרופיל ריבוזומיםת
משמשת ל?
מה התהליך?

Answer 62

משמשת לקביעת אילו מרנא מתורגמים לחלבון בתא.

לוקחים רנא וחושפים אותו לרנאז, רק רנא שנמצא בתוך הריבוזום ולא חשוף ישאר שלם.

השיטה חשפה שפעמים רבות הרנא מוחזק אך מתורגם לחלבון רק בקבלת סיגנל.
וגם, שהתא יכול לשנות את פרופיל החלבונים במהירות כתגובה לשינוי פתאומי.
כמו גם לגלות מסגרות קריאה חדשות וכך גם גנים חדשים.