5. Cinétique enzymatique part 1

Question 1

comment expliquez l’effet de la concentration en substrat et en enzyme ?

Answer 1

par les modèles mathématiques postulés ?

Question 2

donnez l’équation principale de la cinétique enzymatique ?

Answer 2

k1 k2
E + S ⇌ ES ⇀ E + P
k-1
V0 = k2 [ES]

Question 3

que dit le 1er postulat ?

Answer 3

1er Postulat : Si l’on se place en début de réaction, P est très faible et la réaction inverse P→S (k-2 ) peut être considérée comme négligeable
Il est très difficile d’estimer [ES] expérimentalement, on va donc trouver un moyen de le remplacer ma des valeurs mesurables expérimentalement.

Question 4

que dit le 2ème postulat ?

Answer 4

2ème Postulat : Lorsque [S] est en excès par rapport à celle de l’enzyme, l’enzyme est très rapidement saturée (qqes μsecondes = état pré-stationnaire). Ensuite, la réaction atteint un état stationnaire où [ES] reste presque constant (V formation = V disparition)
[ES] = [E]tot[S] / ( (k−1 + k2 / k1) + [S])

Question 5

quelles sont les hypothèses de Michaelis Menten

Answer 5

1. L’enzyme se combine au substrat pour le transformer en produit, puis est régénéré
2. L’enzyme ne « voit » que le substrat (pas encore de produit ni de compétiteur)
3. L’interaction enzyme/substrat a déjà atteint l’équilibre

Question 6

l’équation vitesse de M_Menten

Answer 6

V = Vmax (S)/Km +(S)  
Vmax= k2 [E]tot
Km= k −1 + k2 / k1

Question 7

tracer les graphiques décrivant les hypothèses de Michaelis-Menten ? et que montre l’expérience ?

Answer 7

L’expérience a démontré que la vitesse n’est proportionnelle à la concentration de réactif [S], mais bien à la concentration du complexe [ES].
Si V0 = Vmax / 2 alors [S] = Km -> Km est la concentration en substrat pour avoir la moitié de la Vmax

Question 8

que montre l’équation de Lineweaver_Burk

Answer 8

L’équation de Lineweaver-Burk permet de linéariser l’équation de Michaelis-Menten, et permet d’obtenir une droite de type y = ax + b

Question 9

quelles sont les théories de Lineawever Burk, faites des graphiques ? hypothèse 1

Answer 9

• Dans les conditions où la transformation de ES en P est l’étape limitante (k2 «&laquo_space;K-1) , le Km équivaut au Kd et représente alors l’affinité de l’enzyme pour son substrat.
Mais toutes les enzymes ne fonctionnent pas sur ce schéma. La signification du Km est donc plus complexe qu’il n’y paraît.

Question 10

hypothèse 2 de L-Burk

Answer 10

• Dans les conditions où la transformation de ES en P est l’étape limitante, le k2 définit aussi l’activité catalytique de l’enzyme (kcat )
kcat décrit la vitesse limite d’une réaction enzymatique à saturation, nombre de molécules de substrat transformées en produit par unité de temps et par unité d’enzyme (mole).
V0 = Kcat [E]tot[S] / Km + [S]

Question 11

hypothèse 3 de L-Burk

Answer 11

Et si [S]&raquo_space;> Km, alors V0= kcat [E]tot = Vmax
⇨La vitesse devient indépendante de la concentration en substrat et l’enzyme fonctionne à sa vitesse maximale (100% sous forme ES)
Si [S] «< Km, alors : V0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]𝐾𝑚
⇨ La vitesse devient linéaire en fonction de la concentration en substrat

Question 12

parler des hypothèses permettant d’expliquer l’affinité d’une enzyme ?
hyp 1

Answer 12

• Une enzyme peut très bien avoir une
affinité très forte pour son substrat (Km faible) et une très faible capacité à le convertir en produit (kcat faible)
Inversement, une enzyme qui ne serait saturée qu’à très haute concentration en substrat (Km élevé) peut le convertir très souvent en produit (kcat élevé)
=> Ces deux paramètres pris isolément ne permettent pas de caractériser l’efficacité d’une enzyme ⇨ constante de spécificité Kcat / Km = Ks pour la réaction E + S -> E + P

Question 13

parler des hypothèses permettant d’expliquer l’affinité d’une enzyme ?
hyp 2

Answer 13

o V0 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 𝐸𝑡𝑜𝑡[𝑆] / Km Si [S] «< Km
o La vitesse de la réaction est donc limitée à la vitesse à laquelle E et S diffusent dans une solution aqueuse
o Elle ne peut donc pas être plus importante qu’une valeur maximale théorique (~ 108 - 109 mol-1 sec-1 )
o Les enzymes qui ont une constante de spécifié élevée proche de cette limite sont donc des enzymes très efficaces -> Si l’enzyme est très spécifique, elle va savoir choisir le bon substrat et le transformer rapidement même quand elle se trouve face à un mélange de plusieurs substrats possibles
o Ce ratio 𝑘𝑐𝑎𝑡 / 𝐾𝑚 est souvent utilisé pour comparer le turnover de différents substrats d’une même enzyme -> Mesurer la vitesse relative des substrats lorsque les concentrations sont égales -> l’enzyme va agir de préférence sur le substrat avec le Ks le plus grand

Question 14

parler de l’inhibiteur

Answer 14

• Inhibiteur = Substance qui ralentit la réaction catalysée par une enzyme
o Constante d’inhibition Ki traduit l’affinité de l’enzyme pour l’inhibiteur
o E + I ⇌ EI
o Ki = k−i / ki = 𝐸 [𝐼] / [𝐸𝐼]
o Le Ki est la concentration en inhibiteur pour laquelle la moitié des sites de l’enzymes sont occupés
o Plus le Ki est petit, plus l’inhibiteur à une grande affinité pour l’enzyme
o Plus K𝑚 / Ki est grand, plus l’inhibiteur à une grande sélectivité par rapport au substrat pour l’enzyme
o Réversible :

Question 15

comment expliquer la réversibilité d’une inhibition enzymatique

Answer 15

❖ Liaison faible de l’inhibiteur au site actif de l’enzyme (EI)
❖ L’enzyme retrouve sa fonction après élimination de l’inhibiteur
❖ Compétitive :

Question 16

comment expliquer la compétitivité enzymatique

Answer 16

▪ la liaison de l’inhibiteur (I) et du substrat (S) est mutuellement exclusive
▪ S et I sont en compétition pour leur fixation à E
▪ L’affinité apparente de l’enzyme diminue : 𝑲𝒎 𝒂𝒑𝒑 augmente
Km app = Km ( 1 + [𝐼]𝐾𝑖 )
V0 = Vmax [𝑆]𝐾𝑚 𝑎𝑝𝑝+[𝑆]
▪ L’inhibiteur peut être déplacé par un excès de substrat Vmax n’est pas modifiée
▪ IC50 = 𝐾𝑖𝐾𝑚 [S]+𝐾𝑖 = concentration en inhibiteur pour laquelle la vitesse mesurée (V0Inhib) est la moitié de la vitesse sans inhibiteur (V0)

Question 17

comment expliquez qu’une enzyme est incompétitive ?

Answer 17

▪ la liaison de l’inhibiteur (I) ne se fait que sur le complexe ES. Le site de fixation de I est induit par S
▪ I et S peuvent coexister sur E (ESI)
▪ L’affinité de E pour S augmente 𝑲𝒎 𝒂𝒑𝒑 diminue
▪ L’enzyme apparaît moins active car ESI inactif Vmax diminue
▪ V0 = Vmax app [𝑆]𝐾𝑚 𝑎𝑝𝑝+[𝑆]
▪ Km app = 𝐾𝑚(1+ [1]𝐾𝑖
▪ Vmax app = 𝑉𝑚𝑎𝑥(1+ [𝐼]𝐾𝑖)
▪ IC50 = 𝐾𝑚 𝐾𝑖[𝑆]+𝐾𝑖

Question 18

comment expliquez la non compétitivité pure d’une enzyme ?

Answer 18

▪ la liaison de l’inhibiteur (I) se fait que sur l’enzyme (E) et le complexe ES
▪ S et I sont ne sont pas en compétition pour leur fixation à E
▪ L’affinité apparente de E et EI pour S n’est pas modifiée : 𝑲𝒎 n’est pas modifié
▪ L’enzyme apparaît moins active car ESI est inactif 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑎𝑝𝑝 diminue
▪ Vmax app = 𝑉𝑚𝑎𝑥(1+ [𝐼]𝐾𝑖)
▪ V0 = Vmax [𝑆]𝐾𝑚+[𝑆]
▪ 1𝑉0 = 1𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑎𝑝𝑝 + 𝐾𝑚𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑎𝑝𝑝 1[𝑆]
▪ IC50 = Ki

Question 19

comment expliquez l’inhibition non compétitive mixte ?

Answer 19

la liaison de l’inhibiteur (I) se fait sur l’enzyme (E) et le complexe ES.
▪ S et I sont ne sont pas en compétition pour leur fixation à E
▪ L’affinité de E et ES pour I est différente (𝑲𝒊 et 𝑲𝒊 ′ )
▪ L’affinité de E et EI pour S est aussi différente (𝑲𝑺 et 𝑲𝑺 ′ )
▪ Si Ki > 𝑲𝒊 ′ : pente augmente et 𝑽𝒎𝒂𝒙 𝒂𝒑𝒑 diminue et km app diminue
▪ Si Ki < 𝑲𝒊 ′ : pente augmente et 𝑽𝒎𝒂𝒙 𝒂𝒑𝒑 diminue et km app augmente
▪ 1𝑉0 = 1𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑎𝑝𝑝 + 𝐾𝑚 𝑎𝑝𝑝𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑎𝑝𝑝1[𝑆]
▪ Vmax app = 𝑉𝑚𝑎𝑥α′ ; où α = 1 + [𝐼]𝐾𝑖
▪ Km app = αα′ Km ; où α’ = 1 + [𝐼]𝐾′𝑖

Question 20

comment expliquez l’irréversibilité enzymatique

Answer 20

❖ Liaison forte (covalente) de l’inhibiteur au site actif de l’enzyme (EI)
❖ Inactivation irréversible de l’enzyme même après élimination de l’inhibiteur
❖ Les antibiotiques à cycle β-lactame (pénicilline, Céphalosporines…) : Inhibiteurs irréversibles de la transpeptidase bactérienne
❖ Inhibiteur « suicide » : molécule qui n’a pas une grande réactivité en soi. Lorsqu’il se lie à l’enzyme cible, il est transformé en un composé très réactif qui se combine à l’enzyme et l’inactive de manière irréversible
Plus grande sélectivité pour l’enzyme