WC05 - DNA-technieken

Question 1

Hoe kom je aan het cDNA van humaan EPO?

Answer 1

M.b.v. reverse transcriptase van het mRNA geïsoleerd uit die cellen die het EPO eiwit geactiveerd hebben.

Question 2

Welke basen van de coding streng coderen eigenlijk precies voor het EPO eiwit?

Answer 2

De basen tussen het start- en stopcodon

Question 3

Je wilt met behulp van PCR alleen het deel dat codeert voor het EPO eiwit vermenigvuldigen. Bedenk of het handig is om ook het stopcodon mee te nemen. Schrijf de sequentie op van de primers die je nodig hebt om de PCR uit te voeren. Neem als lengte van de primers 20 basen.

Answer 3

De forward primer is ATG GGG GTG CAC GAA TGT CC
De reverse primer is TCA TCT GTC CCC TGT CCT GC

Question 4

Hoe groot, in baseparen, zal het geamplificeerde EPO cDNA zijn?

Answer 4

Van base 182 naar 763, dus 582 baseparen lang

Question 5

Zorg dat bacteriën, EPO eiwit gaan maken waaraan covalent het GFP eiwit gebonden is aan de N-terminale kant (zie figuur 5.1 rechter figuur). Bedenk ook i) waar je op moet letten bij het achterelkaar zetten van de EPO en GFP cDNA’s ii)hoe je je uiteindelijke vector in de bacteriën krijgt, iii) hoe je er voor zorgt dat alle bacteriën EPO-GFP gaan maken en iv) wat je met dit door bacteriën gemaakte EPO-GFP kan doen/bestuderen.

Answer 5

1. GFP moet dus een startcodon hebben, maar geen stopcodon, en EPO moet een stopcodon hebben.
2. De vector krijg je in de bacterie m.b.v. chemische stoffen of electrische spanning
3. Tijdens het maken bij de vector wordt er een selectiemarker opgeplaatst, zodat de vector met zijn DNA resistent is voor antibiotica. Voor bacteriën voeg je dus een amip(icilline) resistentie toe. Na toevoeging van antibiotica blijven dan alleen dat DNA over met die selectiemarker en het EPO-GFP.
4. Hiermee kun je de activiteit van de cel volgen