HC10 - DNA technologie Flashcards
Hoe maak je een cel of een dier dat een vreemd gen tot expressie brengt?
- DNA van dat gen (dat codeert voor het eiwit) in handen krijgen.
- DNA dat codeert voor het eiwit in expressievector brengen met regulerend DNA.
- Inbrengen van recombinant DNA in cellen (bacteriële/dierlijke)
- Selectie van cellen die recombinant DNA hebben
Hoe zou je het DNA dat nodig is voor het maken van een recombinant eiwit in handen kunnen krijgen?
Door het totale DNA uit het weefsel van het organisme dat het gewenste eiwit van nature maakt, te isoleren. Dit is echter minder geschikt als je alleen het coderende gedeelte wil hebben.
Wat geeft het genomische DNA?
Het hele gen = regulerende gedeeltes + exonen + intronen.
Wat moet je doen als je alleen coderend DNA (exonen) in handen wilt krijgen van een eiwit?
Isoleer mRNA van het organisme dat het gewenste eiwit van nature maakt, en maak DNA van het mRNA met reverse transcriptase (=cDNA, coding DNA)
Hoe isoleer je het gewenste gen/cDNA uit de duizenden andere genen/cDNA’s die je hebt geïsoleerd, maar die niet coderen voor je eiwit?
Je moet het juiste stukje DNA vinden d.m.v. hybridisatie, en alleen dat stukje met PCR vermenigvuldigen.
Wat gebeurt er als je cDNA, dat je hebt geïsoleerd en vermenigvuldigd, inbrengt in een andere cel?
Niets
Het cDNA heeft geen regulerende code/promoter en wordt dus niet overgeschreven/getranscribeerd in mRNA en dus ook niet getransleerd in een eiwit.
Hoe zorg je er voor dat er toch een eiwit wordt gemaakt in een cel wanneer je er verkregen cDNA in stopt?
Je moet er dan een specifieke promoter en regulerend DNA vlak voor plaatsen om te zorgen dat DNA code in mRNA wordt omgezet. De promotor met het regulerend DNA zorgt voor het maken van een eiwit in een cel
Wat is er makkelijk aan een vector?
Een vector is een soort handvat rond stukje DNA (plasmide) zodat je er makkelijk mee kunt werken
- Makkelijk om stukje DNA te vermenigvuldigen
- Makkelijk om stukje DNA te isoleren
- Makkelijk om stukje DNA te combineren met andere stukken DNA
Wat is een vector?
Een kloningsvector is een plasmide (bacterieel mini chromosoom).
- Heeft dubbelstrengs DNA
- Is klein
- Is circulair
- Heeft replicatie origine (rood)
- Heeft knipplaatsen voor restrictie enzymen (multi cloning site, zwart)
- Heeft een gen dat codeert voor een eiwit dat de bacterie resistent maakt tegen antibioticum waarmee je hem later kan selecteren (blauw)
Waar wordt het DNA dat je hebt geïsoleerd en dat codeert voor een eiwit ingebracht nadat er een primer aan is gemaakt?
In een expressievector met regulerend DNA.
DNA van een vector wordt open geknipt, en het DNA fragment wordt er tussen geplaatst. Daarna maakt ligase de bindingen weer dicht.
Hoe wordt het DNA van een vector zo opengeknipt dat een extra DNA fragment kan binden?
Restrictie enzymen knippen DNA alleen bij bepaalde base volgorden en kunnen daarbij ‘sticky’ uiteinden geven.
Wat noem je een expressie vector?
Een vector met een specifieke promoter/genregulerende sequentie
Hoe gebeurt het inbrengen van recombinant DNA in een cel (of in een cellijn, bacterie of gist)
Eerst wordt het DNA ingebracht in een afzonderlijke cel.
Dit heet transfectie.
Dit gebeurt door;
- Chemische stofjes (lipiden - liposomen)
- Electrische spanning
- Injectie
- Virussen
Hoe wordt een selectie gemaakt tussen cellen die recombinant DNA hebben en degene die dat niet hebben?
De vectoren hadden een gen dat codeerde voor een eiwit dat een resistentie voor antibiotica opleverde. Je stelt dus de cellen bloot aan antibiotica, en degene die dit overleven zijn degene met recombinant DNA.
Hoe heet het inbrengen van recombinant DNA in een heel dier?
Gentherapie
Hoe wordt een transgeen dier gemaakt?
Hoe werkt CRISPR-Cas9?
Het spoort een bepaalde DNA sequentie op met een omgekeerd complementaire RNA streng (guide RNA) en knipt het DNA. Bij de knip vindt ‘reparatie’ plaats met het gewenste DNA
