WC03 - DNA diagnostiek Flashcards
BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) is een autosomaal recessieve ziekte die gekarakteriseerd wordt door een sterk gereduceerde expressie van beta2-integrine adhesie moleculen op leukocyten. Zonder beta2-integrine kunnen neutrofielen niet de weefsels in om binnengedrongen pathogenen te vernietigen: BLAD-kalveren sterven meestal jong (<1 jaar) en diegene die overleven groeien slecht. BLAD kan het gevolg zijn van een substitutie van A383 door een G in het gen van de CD18 subunit van het beta2-integrine. De vervanging van A383 door G heeft voor de diagnostiek het prettige gevolg dat het een extra knipplaats introduceert voor een bepaald restrictie-enzym, Hae III (Hae III knipt in GG’CC).
Hier staat de DNA nucleotide sequentie midden uit de coding streng en bijbehorende aminozuursequentie (in de drie reading frames) van een gezond kalf. De A383 naar G mutatie is aangegeven boven de normale sequentie.
A wordt vervangen door G, waardoor er een GGCC ontstaat, wat een nieuwe Hae III knipplaats introduceert. Deze knipt dus GG’CC. Deze knip vindt plaats in het dubbelstrengs DNA.
Beredeneer of deze A naar G mutatie een transitie of een transversie is.
Transitie want het gaat van purine naar purine
Tot welke aminozuur verandering leidt deze mutatie? Bedenk hierbij waar de *** voor staan.
De sterretjes zijn stopcodons. De aspartaat verandert in een Gly, en de andere reading frames zijn niet goed omdat daar stopcodons in zitten en dat kan niet in het midden van het eiwit.
Met behulp van de PCR-methode vermenigvuldigt u een klein stuk DNA rondom de mutatieplaats, van nucleotide 241 tot en met nucleotide 480, van een normaal kalf, een drager en een BLAD kalf. Dat DNA knipt u vervolgens met Hae III.
Geef de sequentie van de primers om deze PCR uit te voeren. Geef de sequentie van de eerste 6 basen. (totale lengte primer meestal ongeveer 20 basen).
- Van de 5’ naar 3’ streng is het 5’ GATGCC 3’ (het einde)
- Van de 3’ naar 5’ streng is het 5’ CCCAAG 3’ (het begin)
Je hebt dubbelstrengs DNA dat wordt gesplitst. De streng die gegeven is is altijd van 5’ naar 3’. De primer begint altijd aan de 3’ kant van de streng, want hij gaat zelf van 5’ naar 3’.
De primer die dezelfde richting op loopt als het gegeven DNA (van 5’ naar 3’) is de forward primer (sense = coding). Het complementeert de 3’ naar 5’ DNA streng.
De primer die de andere richting op loopt als het gegeven DNA is de reverse primer (anti-sense = non coding). Het complementeert de 5’ naar 3’ DNA streng.
Waarom moet een primer uit ongeveer 20 basen bestaan?
Bij een primer van 20 basen haal je de toevallige herkenning eruit, maar is hij nog wel kort genoeg om efficiënt te zijn.
DNA, nucleotiden, polymerase, primers, buffer
Het binnenste van een PCR apparaat bestaat voornamelijk uit een blok met gaatjes, waarvan je het temperatuursverloop precies kan instellen. Welke temperaturen moet je instellen om het stukje DNA van het kalf te vermenigvuldigen? Leg uit welke reacties er bij elke temperatuur plaatsvinden.
De denaturatie van DNA vindt plaats bij 94o C, bij 50o C hechten de primers aan de complementaire streng (annealing), en bij 72o C vindt de verlenging van de ketens plaats.
Hoe groot, in baseparen, zal het geamplificeerde stukje van het gen van de CD18 subunit van het beta2-integrine zijn?
240 baseparen (de primers horen er ook bij)
Wat verwacht u te zullen zien na het knippen met Hae III van het DNA afkomstig van het BLAD-kalf op een gel na elektroforese en DNA kleuring?
Je zult 2 streepjes in de gel zien bij een BLAD-kalf, van de twee verschillende lengtes van de geknipte keten.
Hoe kunt u dragers herkennen met deze methode?
Heterozygoten hebben dus maar 1 van het recessieve allel voor BLAD, en hebben dus zowel een streepje bij de originele lengte van 240 baseparen, als 2 andere streepjes voor de verkorte strengen.
In bovenstaande figuur is de DNA sequentie van een deel (base 301 t/m 438) van het cytochroom-b gen van acht zoogdieren (hoefdieren) weergegeven. Punten betekenen dat de base gelijk is aan die bij de koe. De aminozuur-volgorde van het eiwit bij de koe staat erboven vermeld in de drie-letter-code.
Cytochroom b speelt een rol in de ademhalingsketen. Waar vindt dat proces plaats? N.B. Alhoewel voor de meeste eiwitten die daar gelokaliseerd zijn, de sequentie gewoon in de kern van de cel gecodeerd ligt, is dat voor cytochroom-b niet het geval. Waar ligt die informatie dan wel?
In de mitochondria. Dit DNA is waarschijnlijk overgebleven van toen een prokaryoot een andere prokaryoot opnam, en er dus zo nog DNA achter bleef in de mitochondria. Dit zorgt ervoor dat de mitochondria eiwitten kunnen maken die handig zijn voor de mitochondria zelf, zodat het niet helemaal vanuit de kern hoeft te komen.
Zoals uit de figuur blijkt, is er een sterke overeenkomst tussen de acht genen (zijn er erg veel identieke basen, veel puntjes te zien), maar er zijn toch ook nog behoorlijk wat verschillen te zien. Wat zullen die verschillen in sequentie voor invloed hebben op het functioneren van cytochroom b in die diverse diersoorten?
Ze hebben geen invloed, want anders zou een gedeelte van de ademhalingsketen niet werken en dat is niet mogelijk. Niet alles zou coderen voor dezelfde aminozuren, maar de werking van het eiwit blijft hetzelfde.
Van die verschillen in sequentie kunnen we gebruik maken om:
1. een bepaald species te herkennen;
2. een fylogenetische boom mee samen te stellen (te bekijken hoe sterk twee verschillende species nog “op elkaar lijken”, hoelang geleden in de evolutie ze uit elkaar zijn gegroeid).
Zijn met behulp van dit stuk sequentie de acht species van elkaar te onderscheiden?
Ja ze hebben allemaal wel ergens een andere nucleotide, dus ze zijn allemaal ergens uniek.
Volgens meer conventionele onderzoeksmethoden zijn schapen en geiten 5 miljoen jaar geleden uit elkaar gegroeid, terwijl de scheiding tussen koeien en geiten/schapen al 20 miljoen jaar geleden plaatsvond. Leg uit hoe dat verschil in tijd bevestigd wordt door deze sequentie-analyse.
Er is meer verschil tussen de DNA-sequentie van koeien en geiten/schapen dan onderling tussen geiten en schapen. Veel van de afwijkingen die geiten hebben t.o.v. koeien hebben schapen namelijk ook. Dit geeft aan dat er later pas een scheiding is gemaakt tussen koeien en geiten/schapen dan tussen geiten en schapen.
Met behulp van 2 paar specifieke primers wilt u twee afzonderlijke PCR reacties uitvoeren die òf leidt tot vermenigvuldiging van bovenstaand stukje koeien DNA òf varkens DNA. Wat is de sequentie van de forward primers en wat van de reverse primers die u moet gebruiken? Neem een lengte van 18 basen aan voor de primers.
Koe:
Forward primer is 5’ GGC TTA TAT TAC GGG TCT 3’
Reverse primer is 5’ GAT GAC TGT TGC TCC TCA 3’
Varken:
Forward primer is 5’ GGT CTA TAC TAC GGA TCC 3’
Reverse primer is 5’ GAT GAC CGT AGC TCC TCA 3’
Beschrijf hoe u met bovenstaande primer paren onderscheid kunt maken welk dier gebruikt is voor de gehaktballetjes.
Als je 2 buisjes gebruikt en in de ene de varkens primer en in de andere de koe primer dan weet je welke reageert en welk DNA het dus is.
