VL 7: Transkription

Question 1

Elongation

Answer 1

Wenn sich die RNA-Polymerase entlang der DNA bewegt entspiralisiert sie die Windungen der Doppelhelix und exponiert etwa 10-20 Basen auf einmal, die sich mit RNA Nukleotiden paaren können

• Entry Tunnel DNA
• Auseinandernahme im kurzen Bereich
• RNA Synthese
• i.d.R 8 bp
• ständiges Drehen der DNA
• Stress der Entwindung > kommt zu supercoiling, Torsionsspannung
• Topoisomerase entspannen

Question 2

CTD

Answer 2

• C-terminale Domäne
• Sequenzwiederholung, Repetition
• Je nach Spezies mehr oder wenig häufig
• Bei Eukarya: (YSPTSPS)₅₂
• Ohne Unterbrechung, in Tandem
• 2 und 5 am wichtigsten
• Posttranslationale Phosphorylierungen an diesen Stellen

Question 3

Veränderung der Pol II während der Transkription (Modifikationsphasen der Polymerase)

Answer 3

• Phosphorylierung der CTD verändert sich
• Transkriptionstart vor Zzusammenbau der Pol II, Präinitiationskomplex: unphosphoryliert (CTD)
• Initiale Elongation bedeutet nicht, dass mRNA vollständig gemacht wird, es gibt mehrere Voraussetzungen
• nicht unabhängig von Chromatin
• Diese Schritte ermöglichen unterschiedliche Arten der Transkriptionsregulation

Question 4

Zustände der Polymerase

Answer 4

• Initiation
  
  • Als Präinitiationskomplex vorliegend
  • zusammengebaut
  • Am Promotor
  • noch nicht synthetisierend
• Pausing
  
  • bisschen RNA
  • Polymerase hängt fest
  • an Serin-5 phosphoryliert
• Elongation
  
  • weitere Phosphorylierungen
  • dann prozessiv und produktiv

Question 6

Phasen des Transkriptionsstarts

Answer 6

• nicht unabhängig von Chromatin

1. ksjkg
2. Faktor legt Promotorbereiche frei, partielle Raeumung, Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren, Polymerase → Präinitiationskomplex
3. Bildung offenes Komplex, DNA in der Polymerase entwunden
4. Phosphorylierungssignal, zusätzliche Faktoren, binden direkt an Polymerase, Serin-5. Ihibierende Faktoren, wird wieder gestoppt, aufgehalten/stalled, Verharrung hier möglich
5. 2. Phosphorylierung, auskicken des inhibierenden Faktors
6. Volle durchphosphorylierung möglich, effektive Transkribierung

Question 7

Arten der Transkriptionsregulatione

Answer 7

• On/OffRegulation: Vor der Ausbildung des Präinitiationskomplexes (PIC)
  
  • zB kein offenes Chromatin
  • oder Transkriptionssignal wird gegeben (keine schnelle antwort)
• Schnelle Antwort: nach Ausbildung des PIC
• Massive, ultraschnelle Steigerung der Transkriptionsrate: Aktivierung nach proximaler Pausierung
  
  • verharren im Zustand der ausgebildeten PIC, d.h. nur noch S2 Phosphorylieren, und schon geht Transkripition los

Question 8

Bei welchen Genen ist eine ultraschnelle Antwort notwendig?

Answer 8

• Stressgene
• Hitzeschockpromotoren
• Reaktion auf Stressoren
• Schritt: Phosphorylierung
• kann auch zufaellig passieren

Question 9

Transkriptionstermination in Prokaryoten - ohne Terminationsfaktor

Answer 9

• Sekundärstruktr und das oligo U am 3’ Ende des Transkripts beiwkren Termination ohne Hilfsfaktoren
• Hairpin Loop
• Selbstfaltung der RNA
• piekst Polymerase, Polymerase fällt ab
• Terminationssignl

Question 10

Transkriptionstermination in Prokaryoten - Faktorabhängige Termination

Answer 10

• Rho-Faktor
• 6 UE
• ähnlich Helicase
• erkennt auf naszierende RNA bestimmte Sequenz
• ATP-Verbrauch entlang der RNA
• Löst Hybrid der DNA und RNA auf
• Polymerase fällt ab
• langsamer als Polymerase
• Sequenz nötig, damit Polymerase langsamer wird, sindt kann Rho nicht aufholen

Question 11

Transkriptionstermination in Eukaryoten

Answer 11

• spezielle Faktoren binden naszierende RNA Signalsequenzen (Poly-A-Site)
• RNA wird hier geschnitten
• PolyASchwanz wird an das 3’-Ende der fertigen RNA gehängt
• eine 5’-3’-Exonuklease degradiert die RNA bis Polymerase erreicht ist, die dann vom Template dissoziiert

Question 12

Der CTD belaedt die RNA mit RNA-Prozessierungsfaktoren und die DNA mit Chromatinmodulatoren

Question 13

RNA-Prozessierung

Answer 13

• nur etwa 4% der Gesamt RNAMenge weiner Zelle sind mRNA
• Anzahl mRNA euk. Zelle: 360 000, Masse: 10-30 pg
• Prozessierungsarten
  
  • Capping
  • Polyadenylierung
  • Spleißßen
    
    • prämRNA spleißßen
    • selbstspleißende ntrons
    • Alternatives Spleißen
  • Edierun
    
    • U-Addition/Deletion
    • Desaminierung von Cytidin/Adenin

Question 14

RNA Prozessierung

Answer 14

• mRNA-Prozessierung
  
  • Capping
  • Polyadenylierung
  • Spleissen
    
    • prä-mRNA spleissen
    • selbstspleissende Introns
    • Alternatives Spleisssen
  • Edierung
    
    • U-Addtion/Deletion
    • Desaminierung on Cytidin/Adenin

Question 15

Capping

Answer 15

• Methyliertes Guanin
• 5’-5’ Brücke am Endterminus
• Schutz vor Exonukleasen
• Effizienter Transport aus dem ZK
• Erhöht die Effizienz der Translation

Question 16

Exo- und Endonukleasen

Answer 16

• mRNA abbauende Enzyme
• Endonuklease schneidet vom inneren des Polynukleotids
• Exonuklease attackieren vom ENde

Question 17

Polyadenylierung

Answer 17

• Polyadenylierungsstelle zwischen C und A
• 10-20 Basen stromab vom Signal, das Polyadenylierungsmaschinerie rekrutiert
• Polyadenylierungssignal: AAUA (AUUAA)
• Proteine
  
  • Endonuklease
  • CPSF
  • PAP
  • PABP II
• kann die mRNA vor Abbau schützen
• erhöht die Effizienz der Translation (ca. 20-fach
• Warum A? –> durch ATP ist A viel abundanter inder zelle, [ATP] höher

Question 18

Beispiel Regulation Polyadenylierung - RNA bindendes Protein FCA

Answer 18

• Interaktions mit FY (Polyadenylierungsfaktor)
  
  • Zusammen wirken auf floweriing locus C
  • Autoregulation: verhindert weitere Expression des Gens von FCA
• 2 poly-A Stellen für FCA

Question 19

Beispiel Polyadenylierung - Polivirus

Answer 19

• Viren inhibieren die Expression eukaryotischer mRNAs über die Zerstörung von Proteinen, die am Cap und am Poly-A-Schwaz binden
• Poliovirus -> keine Cap
• RNA-Virus
• Codiert für Proteine, Proteasen
• erstören das PolyA-Bindeprotein
• Reduizert Translation befallener Zellen dramatisch

Question 20

Introns und Exons

Answer 20

• Euk. Gene sind fast immer unterbrochen
• Exons kodieren
• Introns kodieren nicht
• Introns werden ebenfalls transkribiert, nachher ausgeschnitten –> Splicing
• Größe Exons: Durchschnitt 145 nt
• Anzahl Intrns pro Gen: 0-363 (Durchschnitt 9)
• Fröße typischer Introns: Durchschnitt 3300 nt

Question 21

GT-AG-Regel

Answer 21

• Exon/Intron Übergänge sind konserviert
• Jedes Intron beginnt mit GT (GU)
• Endet mit AG
• Branch Site: A

Question 22

Spleißen Chemie

Answer 22

• Besteht aus zwei Transesterifikationen
• Theoretisch müsste keine Energie zugeführt werden
• Tatsächloch werden große Mengen ATP für diverse Umlagerungen im Spleißosom benötigt
• mRNA: Exon-P-GU——A_2’-OH—AG-P-Exon
  
  • Branching Site A_2’-OH (RNA hat noch oxidierenden Sauerstoff an 2’)
    
    • diese OH-Gruppe enzymatisch aktiv
  • 1. Transesterreaktion: OH-Gruppe des branching A attackiert nukleophil Phosphoratom von Phosphatgruppe Exon-P
    
    • Produkt: freies 5’-Exon mit 3’OH Gruppe (Exon-OH) und halbzirkulaere RNA (A mit P verknüpft und zweites Exon liegt frei
  • 2. Transesterreaktion: freies 5’-Exon mit 3’OH (Exon-OH) nukleophiler Angriff auf P-Exon
    
    • Produkte: freies Laria (Lasso) verknüpfte Exons: Exon-P-Exon
• braucht eigentlich keine Energie, Energie steckt in der RNA selbst
• Spleissosom: RNA-basierte Katalyse. Ribozym!

Question 23

Komponentendes Spleissapparates

Answer 23

• ca. 150 Proteine
• 5 RNA Molekü;e (snRNA)
  
  • small nuclear …
  • U-reiche snRNA
    
    • stecken in Partikel U1, U2, etc..
      
      • snRNPs: (snurps) small nuclear Ribonecleoprotein Particles
      • Ribonukleoproteine
• Intron

Question 24

Spleißosom Wirkungsweise, Erkennung

Answer 24

• Erkennung:
  
  • über RNA-RNA Erkennungs-Interaktionen, sequenzspezifisch
  • snurps assemblieren nacheinander abwechselnd auf RNA
    
    • U1 erkennt 5’-Splice-Site
    • BBP (Branch point Binding Protein) erkennt A
    • Proteine die 3’-Splice-Site erkennen
    • U2 verdranengt BBP

Question 25

Das Spleißosom setzt sich am Intron zusammen: Erkennung und Umlagerung

Answer 25

• Transesterreaktion
  
  • Triple-Komplex U4, U5, U6
  • bringt Branch-point und 5”-Spleiss-Site zusammen, zieht U1 und U2 zusammen
  • ersetzt U1

Question 26

Spleißfaktoren restrukturieren das Intron und erlauben damit erst die Katalyse

Answer 26

• 5’-Splice-site und Branching Point werden miteinander kombiniert
• U4 wird rausgeschmissen
• 1. Transesterifikation
• 2. Transesterifikation

Question 27

Spleißvorgang vereinfacht

Answer 27

• Benötigt werden: Spleißapparat (Spleißosom, snurps(snRNP), BBP, etc ) und unreife RNA
• snRNPs assemblieren nacheinander abwechselnd auf die RNA an beiden Intron-Exon-Grenzen und am Branching-Point
  
  • U1 auf 5’-Ende, U2 auf Branchpoint, Proteine auf 3’-Ende
• Restrukturiereung des Introns: Triple-Komplex (U4,U5,U6) bringt U1 und U2 zusammen und katalysiert erste Transesterreaktion.
• zweiter Transesterreaktion
• Produkt: kombiniertes Exon, Intron-“Lasso”