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Genetik > VL 16: Genregulation II: RNAi / Translationsregulation / Entwicklungsgenetik > Flashcards

VL 16: Genregulation II: RNAi / Translationsregulation / Entwicklungsgenetik Flashcards

1
Q

RNAi = RNA interference = RNA Silencing

A
  • post-transkriptionelle Prozesse vermittelt von siRNA und miRNA
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Q

siRNA

A
  • small interfering RNA
  • regulieren RNAs aus denen sie hergestellt werden
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3
Q

RNAi

A
  • RNA interfernce
  • gezielter Abbau von RNAs, für die dsRNA Intermediate vorliegen
  • dsRNA - doppelsträngiges RNA (Sense+Antisense)
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4
Q

RNAi Maschinerie

A
  • Dicer
    • RNAse III (2 aktive Zentren)
    • Zerhackt dsRNA
  • RISC
    • RNA induce silencing complex (Ago = Alicer)
    • enthält Helicase, Endonuclease (Argonaut) und siRNA
    • inaktiv; Entfernung des sense-Stranges aktiviert Enzym
      • Antisense strang (guise) definiert Spezifität
  • siRNA
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5
Q

RNAi Dicing and Slicing

A
  • Dicing
    • Dicer hackt dsRNA vom Ende her in kleine Stücke (=siRNA)
    • Dicer macht dsRNAs mit 2 Nt 3’-Überhang und 5’-Phsophorylierung
  • RISC
    • Argonaute (Stilllegungskomplex) bindet an siRNA und spaltet ds in ss
    • Sense Strang (Passagierstrang wird zerstört, da nicht benötigt
    • anderer vergleibt in Argonaute
    • Slicing: ssRNA wird benutzt um homologe Sequenzen zu erkennen und zu ersetzen
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6
Q

Woher kommen die dsRNAs?

A
  • experimental eingebracht
  • Viren
  • endogene RNAs von Transposons
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7
Q

Funktion RNAi

A
  • Abwehr gegen Viren
  • Transposons, Silencing von Genen (transcriptional gene silening
  • zur Genregulation:
    • Zelle transkribiert absichtlich dsRNA damit sie als Vorlage für RISC dienen und so Gene regulieren können oder Gendefekte werden dadurch erkannt und defekte Gene zerstört
  • Transkriptionale gene-silencing (TGS
    • durch miRNAs/siRNAs
    • Argonaute bindet an frische RNA und rekrutiert Histon modifizierende Enzyme (z.B. Histon-MEthyltransferase/-acetylasen) dadurch wird RNA stärker verpackt und Polymerase kann nicht mehr transkribieren
      • Gen ist stillgelegt
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8
Q

In vivo Applikation von RNAi

A
  • Unterdrückung von Pathogenen, Gendefekten
    • Vorteile gegenüber Pharmazeutika
      • Hochspezifisch, wenig off-target Effekte
      • keine Probleme mit Resistenzen
    • Nachteile
      • geringe Stabilität der siRNAs
    • spezifischer transport schwer
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9
Q

miRNAs

A
  • Micro RNAs
  • Endogene kleine RNAs, die die Expression von Zielgenen unterdrücken (Expression mRNA)
  • In allen Eukaryoten
  • 60% aller mRNAs in Säugern werden von miRNAs reguliert
    • siRNAs regulieren RNAs, aus denen sie hergestellt werden
    • miRNA regulieren Gene in trans → wirken auf andere Stellen im Genom
  • Eine miRNA kann hunderte mRNAs regulieren
  • Normalerweise mit mehreren Bindestellen im 3‘-UTR von mRNAs
  • Unterscheiden sich vonsiRNAs in ihrer Biogenese
  • Expression: einige tausend bis 40000 mmiRNAs / Zelle
  • mRNas sind bei vielen Krankheite involviert
  • miRNAs werden gewebespezifisch exprimiert
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10
Q

pri-miRNAs

A
  • Primäres Transkript
  • miRNAs werden meist mit mRNAs zusammen von Pol II transkribiert
  • oft in Introns
  • Stammschleife (nicht perfekt) notwendig, für Expression der miRNA
  • miRNA teil einer mRNA
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11
Q

Prozessierung von miRNA

A
  • Drosha+Pasha
    • Schneiden Stammschleife heraus (pri-miRNA à pre-miRNA)
  • Exportin
    • Transport Stammschleife aus Kern ins Cytoplasma
  • Dicer
    • Pre-miRNA → miRNA-Duplex (Schneidet Schlaufe ab)
  • RISC
    • miRNA wird eingebaut → programmierter RISC
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12
Q

Wie reprimieren miRNA Genexpression

A
  • miRNA passt nicht perfekt auf Ziel mRNA
  • RISC Komplex stoppt Ribosomen
    • Interaktion mit Kappe funktioniert nicht
  • oder bei Elongation der Ribosomen, die auf dem Weg sind Translation zu machen
  • ORF unterdrückt werden
  • PolyA Schwanz entfernt
  • ZielmRNA werden abgebaut
  • Sehr viele Ziel-RNAs, da weniger spezifisch
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13
Q

Transcriptinal Gene Silencing (TGS) durch miRNAs / siRNAs

A
  • mi- und siRNAs regulieren Genexpression sowohl posttranskriptional und prätranskriptional
    • Regulierung sowohl bei Translation als auch Transkription
  • mi– und siRNA selbst Produkte der posttranskriprionellen Prozessierung
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14
Q

Genregulation auf Translationebene

A
  • uORF
  • NMD
  • Abbau von Proteinen
  • mRNA Lokalisation/Entwicklungsgenetik
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15
Q

Möglichkeiten der Regulation der Translation

A
  • über Initiationsfrequenz
  • Elongation
    • GEschwindigkeit der Ribosomen
  • microRNAs
    • Translationsinitiationsverhinderung an Kappe
    • Verlangsamung der Ribosomen bei der Elongation
  • Zelle
    • Kinasekaskaden
      • z.B. mTOR (c(AS) bestimmt Aktivität, und andere phys. Eigenschaften)
  • mRNA Struktur selbst
    • Erkennungssequenz
    • UTR Struktur
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16
Q

uORF = upstream open reading Frame

A
  • Eukaryotische Translationsregulation, die die Inititation beeinflusst
  • 35% aller Gene im Menschen sind uORFs
  • Mensch: uORFs im Durchschnitt 48 nt lang, 0-13 pro Transkript
  • uORFs reduzieren in den meisten Fällen die Translation des Haupt-ORFs
  • kleine Gene, oft im UTR
  • uORFs reprimieren die Translation von vielen mRNAs
    • Translationshemmer
17
Q

Funktionsweise uORF

A
  • uORF nah am normalen ORF –> starke Repression
  • uOrF weit weg vom CAP –> starke Repression
  • kleine ribosomale UE wird daran gehindert schnell die RN abzuscannen, da sie (wenn schnell mit itRNA beladen) alle uORFs translatiert und sich danach zumeist ablöst
18
Q

NMD = Nonsense Mediated Decay of mRNA

A
  • Abbau von mRNAs die eine Nonsense-Mutation tragen = vorzeitiger Translationss-Stopp
  • Qualitätskontrolle, weil sonst verkürzte, u.U. schädliche Proteine gebildet werden
  • NMD-Signal: Ribosomen bleiben stromauf von einem Exon Junction Complex stecken, bzw. ihnen fehlt ein passender 3’-UTR, der eine korrekte Termination mit-ermöglicht
  • Exon-Junction-Complex: Hinterlassenschaft des Spleißosoms
19
Q

Funktionsweise NMD

A
  • Spleißosom hinterlässe EJC auf mRNA
  • wenn Ribosom an PTC (premature termination codon anhält und wartet abgelöst zu werden, bleiben EJCs über –> darf nicht sein
  • UPFI-3-Protein bindet an Ribosom+EJC und schickt Signal an decapping factor
    • 5’-Schutzkappe wird entfrnt
    • mRNA wird abgebaut
  • nicht translatierte RNAs werden in P-Körperchen abgelagert und abgebaut / NMD ist ein RNA-Abbauweg für defekte mRNAs
    • P-bodies sind nur Ballungen von Aggregaten nicht translatierten RNAs
    • enthalten Komponenten der RNA-Abbau Maschinerie
20
Q

RNA-Abbau in Eukaryoten

A
  • zuerst Decapping
  • 3’–>5’ Abbau durch Exosomen
  • 5’ –> 3’ Abbau und Decapping durch Decapping Komplex in P-Bodies
21
Q

Proteinabbau in Eukaryoten

A
  • über Ubiquitinylierung und das Proteasom reguliert
  • Markierung der zu zerstörenden Proteine durch Ubiquitin
  • von Proteasom erkannt
22
Q

RNA-Transport und Entwicklungsgradienten

A
  • skfn
23
Q

RNA Transport

A
  • benutzt das Cytoskelett
  • Motorproteine transportieren translationsinaktive mRNA-Protein-Komplexe
    • an Mikrotubuli: Kinesin (zum +Pol), Dynein (zum -Pol)
    • an Aktin: Myosin
    • inaktiviert durch Repressoren
  • Motorproteine
    • große Multiproteinkomplexe
    • Kopfdomäne –> Kontakt zum Cytoskelett
    • Schwanzdomäne –> Erkennung der Ladung
    • Rezeptordomäne –> für Vesikel z.B..
24
Q

mRNA Lokalisation in Embryonen

A
  • bestimmt Proteinlokalisation
  • mRNA Gradienten –> Proteingradienten von Transkriptionsfaktoren bestimmen die Entwicklung von Geweben in Drosophila
    • bestimmen in der Zygote Segmeente
    • Gradienten geben Infos z.B. vorne/hinten; oben/unten
    • Konz. Gradienten aktivieren unterschiedlicheZielgene
    • führt zu eine Segmentierung der Genexpression
  • Homöotische Gene wirken als Schalter für die Entwicklung von Organen
    • sind für korrekte Anordnung der Organe zuständig
    • HOX (Homöobox) Gencluster = TFs, die jeder Zelle Ihre Identität verleihen
      • im Genom aller Metazoa
      • Lokus auf Gen = Anordnung im Embryo
      • besitzen große regulatorische Sequenzen (meist Enhancer) und kleine codierende Seq.

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