VL 16: Genregulation II: RNAi / Translationsregulation / Entwicklungsgenetik

Question 1

RNAi = RNA interference = RNA Silencing

Answer 1

• post-transkriptionelle Prozesse vermittelt von siRNA und miRNA

Question 2

siRNA

Answer 2

• small interfering RNA
• regulieren RNAs aus denen sie hergestellt werden

Question 3

RNAi

Answer 3

• RNA interfernce
• gezielter Abbau von RNAs, für die dsRNA Intermediate vorliegen
• dsRNA - doppelsträngiges RNA (Sense+Antisense)

Question 4

RNAi Maschinerie

Answer 4

• Dicer
  
  • RNAse III (2 aktive Zentren)
  • Zerhackt dsRNA
• RISC
  
  • RNA induce silencing complex (Ago = Alicer)
  • enthält Helicase, Endonuclease (Argonaut) und siRNA
  • inaktiv; Entfernung des sense-Stranges aktiviert Enzym
    
    • Antisense strang (guise) definiert Spezifität
• siRNA

Question 5

RNAi Dicing and Slicing

Answer 5

• Dicing
  
  • Dicer hackt dsRNA vom Ende her in kleine Stücke (=siRNA)
  • Dicer macht dsRNAs mit 2 Nt 3’-Überhang und 5’-Phsophorylierung
• RISC
  
  • Argonaute (Stilllegungskomplex) bindet an siRNA und spaltet ds in ss
  • Sense Strang (Passagierstrang wird zerstört, da nicht benötigt
  • anderer vergleibt in Argonaute
  • Slicing: ssRNA wird benutzt um homologe Sequenzen zu erkennen und zu ersetzen

Question 6

Woher kommen die dsRNAs?

Answer 6

• experimental eingebracht
• Viren
• endogene RNAs von Transposons

Question 7

Funktion RNAi

Answer 7

• Abwehr gegen Viren
• Transposons, Silencing von Genen (transcriptional gene silening
• zur Genregulation:
  
  • Zelle transkribiert absichtlich dsRNA damit sie als Vorlage für RISC dienen und so Gene regulieren können oder Gendefekte werden dadurch erkannt und defekte Gene zerstört
• Transkriptionale gene-silencing (TGS
  
  • durch miRNAs/siRNAs
  • Argonaute bindet an frische RNA und rekrutiert Histon modifizierende Enzyme (z.B. Histon-MEthyltransferase/-acetylasen) dadurch wird RNA stärker verpackt und Polymerase kann nicht mehr transkribieren
    
    • Gen ist stillgelegt

Question 8

In vivo Applikation von RNAi

Answer 8

• Unterdrückung von Pathogenen, Gendefekten
  
  • Vorteile gegenüber Pharmazeutika
    
    • Hochspezifisch, wenig off-target Effekte
    • keine Probleme mit Resistenzen
  • Nachteile
    
    • geringe Stabilität der siRNAs
  • spezifischer transport schwer

Question 9

miRNAs

Answer 9

• Micro RNAs
• Endogene kleine RNAs, die die Expression von Zielgenen unterdrücken (Expression mRNA)
• In allen Eukaryoten
• 60% aller mRNAs in Säugern werden von miRNAs reguliert
  
  • siRNAs regulieren RNAs, aus denen sie hergestellt werden
  • miRNA regulieren Gene in trans → wirken auf andere Stellen im Genom
• Eine miRNA kann hunderte mRNAs regulieren
• Normalerweise mit mehreren Bindestellen im 3‘-UTR von mRNAs
• Unterscheiden sich vonsiRNAs in ihrer Biogenese
• Expression: einige tausend bis 40000 mmiRNAs / Zelle
• mRNas sind bei vielen Krankheite involviert
• miRNAs werden gewebespezifisch exprimiert

Question 10

pri-miRNAs

Answer 10

• Primäres Transkript
• miRNAs werden meist mit mRNAs zusammen von Pol II transkribiert
• oft in Introns
• Stammschleife (nicht perfekt) notwendig, für Expression der miRNA
• miRNA teil einer mRNA

Question 11

Prozessierung von miRNA

Answer 11

• Drosha+Pasha
  
  • Schneiden Stammschleife heraus (pri-miRNA à pre-miRNA)
• Exportin
  
  • Transport Stammschleife aus Kern ins Cytoplasma
• Dicer
  
  • Pre-miRNA → miRNA-Duplex (Schneidet Schlaufe ab)
• RISC
  
  • miRNA wird eingebaut → programmierter RISC

Question 12

Wie reprimieren miRNA Genexpression

Answer 12

• miRNA passt nicht perfekt auf Ziel mRNA
• RISC Komplex stoppt Ribosomen
  
  • Interaktion mit Kappe funktioniert nicht
• oder bei Elongation der Ribosomen, die auf dem Weg sind Translation zu machen
• ORF unterdrückt werden
• PolyA Schwanz entfernt
• ZielmRNA werden abgebaut
• Sehr viele Ziel-RNAs, da weniger spezifisch

Question 13

Transcriptinal Gene Silencing (TGS) durch miRNAs / siRNAs

Answer 13

• mi- und siRNAs regulieren Genexpression sowohl posttranskriptional und prätranskriptional
  
  • Regulierung sowohl bei Translation als auch Transkription
• mi– und siRNA selbst Produkte der posttranskriprionellen Prozessierung

Question 14

Genregulation auf Translationebene

Answer 14

• uORF
• NMD
• Abbau von Proteinen
• mRNA Lokalisation/Entwicklungsgenetik

Question 15

Möglichkeiten der Regulation der Translation

Answer 15

• über Initiationsfrequenz
• Elongation
  
  • GEschwindigkeit der Ribosomen
• microRNAs
  
  • Translationsinitiationsverhinderung an Kappe
  • Verlangsamung der Ribosomen bei der Elongation
• Zelle
  
  • Kinasekaskaden
    
    • z.B. mTOR (c(AS) bestimmt Aktivität, und andere phys. Eigenschaften)
• mRNA Struktur selbst
  
  • Erkennungssequenz
  • UTR Struktur

Question 16

uORF = upstream open reading Frame

Answer 16

• Eukaryotische Translationsregulation, die die Inititation beeinflusst
• 35% aller Gene im Menschen sind uORFs
• Mensch: uORFs im Durchschnitt 48 nt lang, 0-13 pro Transkript
• uORFs reduzieren in den meisten Fällen die Translation des Haupt-ORFs
• kleine Gene, oft im UTR
• uORFs reprimieren die Translation von vielen mRNAs
  
  • Translationshemmer

Question 17

Funktionsweise uORF

Answer 17

• uORF nah am normalen ORF –> starke Repression
• uOrF weit weg vom CAP –> starke Repression
• kleine ribosomale UE wird daran gehindert schnell die RN abzuscannen, da sie (wenn schnell mit itRNA beladen) alle uORFs translatiert und sich danach zumeist ablöst

Question 18

NMD = Nonsense Mediated Decay of mRNA

Answer 18

• Abbau von mRNAs die eine Nonsense-Mutation tragen = vorzeitiger Translationss-Stopp
• Qualitätskontrolle, weil sonst verkürzte, u.U. schädliche Proteine gebildet werden
• NMD-Signal: Ribosomen bleiben stromauf von einem Exon Junction Complex stecken, bzw. ihnen fehlt ein passender 3’-UTR, der eine korrekte Termination mit-ermöglicht
• Exon-Junction-Complex: Hinterlassenschaft des Spleißosoms

Question 19

Funktionsweise NMD

Answer 19

• Spleißosom hinterlässe EJC auf mRNA
• wenn Ribosom an PTC (premature termination codon anhält und wartet abgelöst zu werden, bleiben EJCs über –> darf nicht sein
• UPFI-3-Protein bindet an Ribosom+EJC und schickt Signal an decapping factor
  
  • 5’-Schutzkappe wird entfrnt
  • mRNA wird abgebaut
• nicht translatierte RNAs werden in P-Körperchen abgelagert und abgebaut / NMD ist ein RNA-Abbauweg für defekte mRNAs
  
  • P-bodies sind nur Ballungen von Aggregaten nicht translatierten RNAs
  • enthalten Komponenten der RNA-Abbau Maschinerie

Question 20

RNA-Abbau in Eukaryoten

Answer 20

• zuerst Decapping
• 3’–>5’ Abbau durch Exosomen
• 5’ –> 3’ Abbau und Decapping durch Decapping Komplex in P-Bodies

Question 21

Proteinabbau in Eukaryoten

Answer 21

• über Ubiquitinylierung und das Proteasom reguliert
• Markierung der zu zerstörenden Proteine durch Ubiquitin
• von Proteasom erkannt

Question 22

RNA-Transport und Entwicklungsgradienten

Answer 22

• skfn

Question 23

RNA Transport

Answer 23

• benutzt das Cytoskelett
• Motorproteine transportieren translationsinaktive mRNA-Protein-Komplexe
  
  • an Mikrotubuli: Kinesin (zum +Pol), Dynein (zum -Pol)
  • an Aktin: Myosin
  • inaktiviert durch Repressoren
• Motorproteine
  
  • große Multiproteinkomplexe
  • Kopfdomäne –> Kontakt zum Cytoskelett
  • Schwanzdomäne –> Erkennung der Ladung
  • Rezeptordomäne –> für Vesikel z.B..

Question 24

mRNA Lokalisation in Embryonen

Answer 24

• bestimmt Proteinlokalisation
• mRNA Gradienten –> Proteingradienten von Transkriptionsfaktoren bestimmen die Entwicklung von Geweben in Drosophila
  
  • bestimmen in der Zygote Segmeente
  • Gradienten geben Infos z.B. vorne/hinten; oben/unten
  • Konz. Gradienten aktivieren unterschiedlicheZielgene
  • führt zu eine Segmentierung der Genexpression
• Homöotische Gene wirken als Schalter für die Entwicklung von Organen
  
  • sind für korrekte Anordnung der Organe zuständig
  • HOX (Homöobox) Gencluster = TFs, die jeder Zelle Ihre Identität verleihen
    
    • im Genom aller Metazoa
    • Lokus auf Gen = Anordnung im Embryo
    • besitzen große regulatorische Sequenzen (meist Enhancer) und kleine codierende Seq.