VL 4: Verpackung und Lokalisierung des genetischen Materials Flashcards
Wie kommt Spannung in die DNA?
- Topologie (Supercoiling) ständig beeinflusst durch Replikaitonsprozessse und Transkriptionsprozeesse
- es kommt zu Spannungen die abgebaut werden müssen
- prokaryotische Zellen nutzen Topoisomerasen um aktiv Spannung (Supercoiling) herzustellen
Topoisomerasen
- Enzyme, die die Topologie der DNA verändern
- wichtig um Spannung der DNA abzubauen
Topoisomerasen vom Typ IA
- 2 Aktivitäten: Schneidet, Verknüpft
-
Nukleaseaktivität
- schneiden nur einen der beiden Stränge
- führen den anderen durch die Lücke
- Strang gelangt auf andere Seite
-
Ligationsreaktion
- Verknüpfung
- verändern die Linking number in Einerschritten
Topoisomerase vom Typ IB
- wirken als Drehgelenk
- schneiden 1 Strang
- freies Ende rotiert frei
- Enzym kann mehrfache Drehungen machen
- Topoisomerase verknüpft wieder
DNA Topoisomerasen vom Typ II
- schneiden Doppelstrang
- führen anderen Strang durch die Lücke
- Ligationsreaktion,
- bestehen aus mehreren UE
- benötigen ATP
- Änderung der Lk in Zweierschritten
- Spezialfall Bakterien: Gyrase
- kann Spannung einführen, dh. entgegen des Spannungsgefälles
- aktive Einführung von Superhelikalität
Wie kann Gyrase attackiert werden (Antibiotikum)
- man inhibiert nicht die Topoisomerase komplett
- KZ, welches DNA schneidet wird nicht inhibiert
- nur Ligationsschritt (Zusammenknüpfen) wird inhibiert
→ Gyrase schnibbelt DNA, DNA Fragmente werden für die Zelle tödlich
Topoisomerasen vom Typ II können verschiedene topologische Strukturen auflösen
- lösen Supercoiling auf
- Zusammenhängende DNAMoleküle (Plasmide) trennen
- Knoten auflösen
- Superhelikalität einbringen
Knotty Problem
- beim Aufteilen der DNA Stränge
- mehr Twists beim auseinander nehmen der Stränge
- Coiling tritt auf um Spannung zu erleichtern
- Um das Problem zu lösen muss periodisch DNA aufgeschnitten und wieder zusammengeführt werden
- Topoisomerase I –> löst einen Twist auf
- Topoisomerase II –> löst zwei Twists auf
Eigenschaften von DNA Topoisomerasen
Chromosomen und Chromatin
Interaktion der DNA mit Proteinen
Größe Genoms verschiedener Organismen
Wie lang ist unser Genom?
3,3*109 x 0,33 nm = 1,09 m
1,09 m x 2 = 2,18 m
In welchem Bereich liegt unser Genom umgerechnet in Byte? Informationsgehalt??
- pro Position im Genom = 2 Bit
- 8 Bit = 1 Byte
- 3,3 x 109 x 2 = 6 x 109
- 6 x 109 : 8 = 750 000 000 Byte = 715 MB
- 1 CDRom
Bis auf Abfolge der bp, wodurch bestimmt sich der Informationsgehat noch?
- der genetische Code
- (epigenetischher Coode)
- und und und…..
- verschiedene Ebenen von Kodierungen
sDie Komplexität des Genoms (Wie geht diese verloren?)
- Komplexität verloren durch Repetitionen von Sequenzen
- Riesengenome haben einfach mehr rep. Sequenzen
- 40 : 60 bei Menschen
- e.Coli hat keine repetitive Sequenzen
DNA-Sequenz-Typen im Genom des Menschen
Aufteilung der gesamten DNA Sequenzen
- Sequenzen die mit Genen zu tun haben (33%)
- Exons: Sequenzen die für Proteine kodieren (0,015%)\
- Verwandte Sequenzen (nur sekundär wichtig für Proteinkodierung)
- Pseudogene (sehen aus wie Gen, werden nicht benutzt
- Genfragmente (unfunktional)
- Introns
-
extragenische DNA (66%)
- Repetitive DNA (~50%)
- Tandem Repeats DNA (hintereinander)
- Satelliten
- Mikrosatelliten
- Minisatelliten
- Verstreute (zufaellig verteilt)
- Transposons
- SINEs (ehemalige retrotranspons (parasiten etc))
- LINEs
- LTR
- Tandem Repeats DNA (hintereinander)
- unikal
- Repetitive DNA (~50%)
Repetitive DNA
- Mittelrepetitive DNA : 10 - ca, 106 Kopien/Genom
- Minisatelliten DNA
- Microsatelliten DNA
- Transposons
- LINES, SINE u.a. Retroelemente (s. Vorlesung über Transposons)
- Gene mit vielen Kopen (z.B. ribosomale RNA-Gene, Histongene)
- Hochrepetitive DNA: > 106 Kopien/Genom = Satelliten-DNA
Aufbau und Funktion der Chromosomen
Genomorganisation in Prokaryoten
E. coli
- lange Jahre Modellbakterium
- Größe 1-2*0,8 mikrometer
- Genomgröße
- 4.5 Mio bp, 4377 Gene
b.subtilis
- DNA Anfärbung (blau)
- große Region
- kein Zellern
- Segregation vor Teilung auch sichtbar
Genomorganisation in Prokaryoten
- DNA Anfärbung
- große Region
- kein Kern
- Segregation vor Teilung auch sichtbar
- Schleifenartige Strukturen
- supercoiled
- funktionelle Domänen
- 500 Schleifen in e.Coli
- Proteinkern mit verschiedenen Proteinen
- Proteinkern von dem aus superspiralisierte DNA-Schleifen ausgehen
- Schleifen = funktionelle Domänen
- 10 000 bp
Genomorganisation in Eukaryoten
- überwiegende Menge der Gne in Chromosomen des Zellkerns
- zusätzliche Gene in Mitochondrien, sowie Plastiden
Chromatin im Zellkern
- Bereiche im ZK dichter verpackt
- DNA unterschiedlich dicht verpackt
Chromatin
- aufgelockert
- Interphase
Chromosomen
- Kondensiert
- Mitose, Meiose
Polytänchromosomen
- in Speicheldrüsen von Insekten
- ablesen von Genen die wichtig sind für Speichelproduktion, Nahrungsaufnahme/Gifte
- spezialisierte funktion benötigt hohe Produktion von bestimmten Proteinen
- Lösung: DNA wird vervielfacht
- dutzende bis hunderte gepaarte Chromatiden
- keine Kondensierung → keine Transportform, sondern aktive Form
- DNA wurde vervielfacht –> Polyploid (nicht diploid), nicht 2 Schwetserchromatiden, sondern mehrere
- Chromsomen angefärbt
- Bänderungsmuster
- spiegelt Organisation des Chromatins wider
- wichtig für Analysen
*
DNA-Sonden
- DNA-Sonden sind kurze, einzelsträngige DNA-Fragmente, die zum Detektieren komplementärer DNA- oder RNA-Sequenzen eingesetzt werden.
- fluoreszenzfarbstoffmarkiert
- hybridisierung
Fluoreszenzmuster Polytänchromosomen
- sichtbare Sequenzen die ähnlich der Sonden
- einige unikal, alles andere Blau (hintergrundfärbung)
- komplexe Muster
- in diesem Fall: Bindestellen für Transkriptionsfaktoren wurden sichtbar gemacht
Polytänchromosomen: Puffs als aktive Bereiche
- Puffregionen entpackt
- Enzyme können angreifen
- RNA produzieren
Wie kann man nachweisen, dass da Aktivität stattfindet?
- radioaktive Nukleotide können da binden, so wirde bewiesen
Wie kann man beweisen, dass in den Puffs der Polytänchromosomen Aktivität stattfindet?
- Produktion von mRNA wird bewiesne
- man bietet radioaktive Ribonukleotiden (angefärbt)
- grundeinheit von RNA, die polymerisiert werden
- Radioaktive Bereiche in kürzeste Zeit
Lampenbürstenchromosomen des Marmormolches (Tritutus marmoratus)
- im Diplotän der Meiose
- an entspiralisierten Schleifen findet Transkription statt
- nur in Meisose Prophase I
- homologe Chromosomen in der Eizelle
- am Chiasma, wo gen. Info ausgetauscht wird, verbunden
- sollte Transportform sein
- allerdings arretierte Meiose, sind stuck
- partielle Kondensierung stattgefunden in der Meiose
- Loops sind die Bereiche die aktiv sind
- Transkription in Loopbereichen
Spezialfälle, aktive Zellen Chromosomen sichtbar
- Polytänchromosomen
- Diplotänchromosomen
Chromosomenterritorien in der Interphase
- Bereiche
- nicht zufällig
- Verteilung Chromosomen im ZK nach Plan
- bestimmte Chromsoemen interagieren häufiger miteinander
CCC = 3C = Chromosome Conformation Capture, Analyse der 3D Konformationen der Chromosomen
- dient 3D Konformation der Chromosomen im Zellkern zu analysieren
- Organisation in Interphase ist nicht zufällig
- versch. Chromosomen, versch. Kontaktstellen
- Interaktion zweier Chromosomen kann man über Crosslink (chem. Veränderung, in der Abbildung Rot) festigen
- um Kontaktstellen ident. muss man chromosomen zerschneiden
- zufällig
- es entsteht ein X
-
Ligation: Enden werden verbunden
- es entsteht eine 8
- Einbau des Captures (in Abbildung grün) an Ligationsstelle (chemische Gruppe, erlaubt uns DNA zu fangen später)
-
Auflösung Crosslink
- Zirkuläres Molekül entsteht
- Restriktionsenzyme schneiden wieder zufällig (in Abbildung gelb)
- Erhalten zwei Fragmente mit Capture
- Antikörper des Captures fangen diese
- künstliche Ligierung von DNA Sequenzen an Enden der Fragmente
- Primer binden an kuenstliche Seq
- Amplifikation der Fragmente, PCR
- Next Generation Sequencing analysieren (Seq bestimmen)
- Sequenzstellen der beiden benachbarten Chromosomen ist identifiziert!
- ungefähre bestimmung wo chromosomen benachbart waren!
Die Topologie der Interphasenchromosomen
- nicht zufällig
- Pfeil: Nucleolis = rDNA
- wo chromosmen miteinander lokalisieren
- Centromere (circle)
- ein Bereich kein Kontakt zum Rest
- rDNA
- Produktion der Ribosomen
Kondensierte Chromosmen
- Mitosechromosomen
- Verpackte Form
Chromosomen-Regionen
- Znetromere (Verteilung)
- Telomere, Stabilitaet Replikation
- NOR (rRNA, Nucleolis, Ribosomenbildung)
Zentromer Funktionen
- für Verteilung waehrend der Mitose wichtig
- Satelliten DNA (rep. DNA), die Einbau von Spezialhistonen ermöglicht
- erlaubt Einbau weitere Proteinenschicht, Kinetochor
- Kinetochor heftet an Mikrotubuli (Transportmaschine der Zelle)
- Transport durch Polymerisierung und Depolymerisierung
- Informationsstelle
- Ziehen Schwesterchromatiden an jeweiligen Pol
- mehrere Mikrotubuli an ein Zentromer
- Satelliten DNA
Das Hefezentromer
- 3 wesentliche Elemente bilden Nukleosom
- Ein Mikrotubuli schaffts
Artspezifische Centromere
Centromere: Anheftungspunkte für Mikrotubuli in der Mitose
- wie Chromosomen Aussehen und DNA-Gehalt ändern währen der Mitose
- Schwesterchromatiden am Centromer verknüpft
- holozentrisch Chromosome (bei Pflanzen, und Würmern), ganzes Chromatidenpaar ist Andockstelle für Kinetochor und anschliesslich mehrere Mikrotubuli
*
Zellzyklus
G1: Wachstumsphase, Gapphase 3 h
G0: nicht teilungsfähig (Neuronen, Muskelzellen)
S-Phase: Synthese von DNA, 8 h, Replikation
G2: Vorbereitungsphase, löst Organellen auf, Kontaktstellen aufbrechen;2 h
Mitose
Problem genetische Konstitution, sind wir in G1 haploid?
nein. 2 homologe Chromosomen
Sind wir in der G1-Phase haploid
- Nein.
- man hat 2 homologe Chromosomen
- in G2 Phase hat man 4 homologe Chromosomen
Telemor Struktur
- repet. DNA
- 6 Nukleotide, 1000 fach hintereinander gehängt, TTAGGG (in allen Säugetieren)
- teilweise einzelsträngig, 3’-überhang, Gegenstrang fehlt
- Einzelstrang verdrängt Teile des Doppelstrangs im Telomer, Hybridisierung → Displacement Loop
Chromosomenbereiche und Chromatin
- Bereiche um Telomere und Centromere sehr dicht gepackte DNA → Heterochromatin
- Arme weniger dicht verpackt
Chromatin und Nukleosomen
- Verpackung von Chromosomen nicht komplett gelöst in der Biologie
DNA vs Chromosom
- DNA 10 cm pro Chromosom
- verpacktes Chromosom 2-10 mikrometer
- 10 000 -20 000 fache Verkürkung
- Verpackungsleistung!!
- kleines Volumen im ZK
- Kondensation! hohe Leistung super Wie?
Verpackung von Chromosomen, Level 1
- Verpackungsmaterial: Condensine und Kohesine
-
Kohesine
- haelt Schwesterchromatiden zusammen
- Ringförmige Proteine
- passiert während der Replikation und Kondensation in Prophase der Mitose
- in Metaphase, bei Anordnung der Chromatiden helfen weitere Proteine die Schleifen zusammen zu halten → Kondensine
- in Anaphase werden die Verknüpfungen losgeworden, Spaltung Kohesine
- Kondensine bleiben erhalten
Verpackung von Chromosomen, Level 2
- bestehen aus Chromatinfasern, die an einem Scaffold befestigt sind
- gleichmässig grosse Loops (100 000 bp)
- Loops sind nicht Strang sondern es gibt weitere V erpackungsebenen
Verpackungsmaterial
Cohesine
Kondensine
Cohesine
- Proteine
- halten Schwesterchromatiden zusammen
- Ringförmig
- während S-Phase (Replokation
- auch währen d der Kondensation der Chromosomen in der Prophase
- beim Übergang von Metaphase zur Anaphase werden Cohesine gespalten
Condensine
- bei Kondensation
- benachbarte Loops werden zusammengehalten
- Kondensine sind von Spaltung der Cohesine während Anaphase nicht betroffen
Verpackung von Chromosomen, Level 3
- ‘spiralig aufwgewickelt’
-
30 nm Faser und 10 nm Faser
- aus Nukleosomen
- DNA umwickelt Histone
Besetzung des Kernes mit aufgewickelter Interphase chromosomaler DNA und dazugehörigen Proteinen
36%
- viel Raum benötigt für andere Sachen
- Transkriptionsmaschinerie blabla
*
Schematischer Aufbau der 10 nm und 30 nm Fasern
- Viele verschiedene Modelle für 30 nm Faser
- Stapelungen, Säulen, Helikal, alternierend, etc.
Nukleosom
- besteht aus DNA
- Histonen
- DNA um Histone gewickelt
Histone - Domänenstruktur
- mehrere Proteine (8)
- 4 Typen und Subtypen
- H2A
- H2B
- H3
- H4
- wechselwirken miteinander
- invariabel –> alle Eukaryoten haben Histone
- sehr gut entwickelt
- jede AS selektiert
Nukleosomen bestehen aus einem Kern von 8 Histonproteinen
- Schwänze schauen raus
- Endtermini
Histonoctamer
- 2 Moleküle H2A
- 2 Moleküle H2B
- 2 Moleküle H3
- 2 Moleküle H4
- um das Histon-Octamer ist die DNA gewickelt: 146 bp = 1,7 Windungen
- ziehen DNA an sich ran
- kleine Furche kontaktiert von Histonproteinen
- große Furche leichter erreichbar auf der anderen Seite, für z.B. Transkriptionsfaktoren
- Phosphatrückgrat
- AS interagieren
*
H1
- Linkerhiston
- hilft
- Linkerhiston H1 bindet im Bereich des Austritts der DNA aus dem Nukleosom
- DNA, die an 2 Positionen aus Nukleosom rausläuft näher aneinander zu bringen
- Bindung von H1 zur 10 nm Faser führt zur Kompaktierung des Chromatins
- a: ohne H1
- b mit H1
Regulation des Chromatin
- Euchromatin und Heterochromtin
Unterscheidung Euchromatin und Heterochromatin
- andere Histonvarianten
Andere Histonvarianten
- Im Bereich des Kinetochors ist das Histon H3 durch CENP-A ersetzt
- CENP-A erlaubt Interaktion mit anderen Protein
- Proteine die das Kinetochor bilden
Nukleosomen bzw DNA können sich bewegen - ‘Atmung’
- DNA bewegt sich auch
- jedes Nukleosom ‘atmet’
- Halbabwicklkungen
- alle 25 ms kann das passieren
- Zugängliche Sequenzen können gelesen werden
- Standarddarstellung von Nukleosomen als 146 bp um Histonprotein, ist dominante Form des Nukleosoms
- Bestimmtes Freihalten der DNA kann auch aktiv unterstützt werden durch Transkriptionsfaktoren
- erkennen best. Sequenzen, sorgen dafuer dass im Bereich zwischen den beiden Proteinen kein Nukleosom assemblieren kann (weil zb zu kurz)
- oder: Festhalten des Nukleosoms, schwerer zugänglich
Positionierung von Nukleosomen
Freihalten der DNA
- Aufgabe Transkriptionsfaktoren
- erkennen Sequenzen
- Nekleosomfreie Stelle
Festhalten der DNA
- Proteine interagieren
- schwerer zugänglich
Welcher Anteil des Genoms ist wirklich verpackt in Nukleosomen
70-90 % sind verpackt in der Standard Interphasekern
Was ist besonders haeufig frei und was ist besonders haeufig verpackt?
- *Verpackt**: Telomere, Centromere, Satelliten DNA, rep. DNA
- *Frei**: Transkriptionsstartstellen, tRNA, rRNA, aktive Stellen
Remodeling von Nukleosomen
- sliding
- Nukleosom bewegt sich auf dna sequenz
- transfer
- verstztung
- major groove außen besser zugänglich
übergänge von Euchromatin zu Heterochromatin
Die N-Termini der Histone ragen aus dem Nukleosom heraus
- reversibel modifizierte N-Termini
- post-translational
Modifikaitonen der N-Termini
- Unterschiedliche Arten der Aminosäuremodifikationen
- P
- A
- M
- U
- dynamische Veränderungen
- reversibel
- Enzyme
Wozu dienen die N-Termini?
WW zwischen N-Terminalen Domänen der Histone benachbarter Nukleosomen
30 nm Faser
Histonmodifikationen verändern den Nukleosomenzustand
Wirkungen der Modifikaitonen
- Acetylierung
- verändern Eigenschaften
- offene Konformation
- Bromodomänen (Proteine) erkennen Acetylierungn
- halten auf
- Methylierung
- Chromodomänen
- mehr Interaktionen
- klebriger “” zwischen benachbarten Histonen
- eher geschlossene Konformation zwischen Nukleosomen
Histoncode: epigenetischer Code
- epigenetischer Code = nicht in der Sequenz der DNA
- keine Codierung AS
- Förderung und Hemmung der Bindung von Faktoren
- Direkte Änderung der DNA-Histon Struktur
Multiple DNA- und Histonmodifikationen Faktoren beeinflussen den Chromatinzustand
offenes Chromatin
- Histon-Methylierung
- Histon-Deacetylierung
- Einlagerung von Histonen und Heterochromatin-Proteinen
- DNA-Methylierung
kondensiertes Chromatin
- Histon Demethylierung,
- Histon-Acetylierung
- Verlust von Histonen und Heterochromatin-Proteinen
Methylierung der DNA
- DNA Methyltransferase
- Cytosin, an Position 5
- besser verpackt
- Gen Stromab wird nicht translatiert
