VL 5: Replikation Flashcards
DIe Replikation von DNA
Formale Möglichkeiten wie ein DNA-Molekül repliziert werden kann
Meselson Stahl Experiment
- Durchführung an E.coli
- Grundlage: chem. Markierung DNA, nach Replikation, nur eine Hälfte des Tochter-DNA-Doppelstrang weist Markierung auf
- Marker: Stickstoffisotop 15N
- Beifügung 15NH4Cl zum Kulturmedium
- Einbau in heterozyklischen Basen der DNA
- 14 Generationen wachsen lassen
- → Bakterielle DNA ist mit diesem Sticksttoffisotop gesätigt
- Auswechslung des Mediums
- Weitere Replikationsrunden 14N
- 15N und 14N-haltige DNA-Stränge aufgrund Dichteunterschieds durch Dichtegradienten-Gleichgewichtszentrifugation trennbar
- Aufzucht von E.Coli in Medium mit schwerem Stickstoff-Angebot
- Alle DNA 15N
- Zentrifugieren, Aufnahme in Medium mit Standard Stickstoff (14N), 2 Generationen wachsen lassen
- nach Gen 1: nur mittelschwere DNA (koennte auch dispersiv sein)**
- nach Gen 2: je zur Hälfte mittelschwer und normale DNA
** Wie kann man schon an dieser Stelle wissen, dass Replikaiton semikonservativ is?
→ Trennung der DNA Stränge. Wenn trotzdem mittelschwer, dann dispersiv, wenn zwei Banden erscheinen, mittelschwer + normal, dann semikonservativ
- Relative Mengen innerhab der Gesamt-DNA ermittelbar
- Nach 1 Generation in 14N-haltigen Medium
- Doppelhelix besitzt Schwimmdichte, die einen Mittelwert zwischen der Dichte völlig 14N-markierter DNA und 15N-markierter DNA
- à 50/50 Gehalt beider Isotope
Das Meselson-Stahl Experiment
- nachweis für semikonservative Replikation
- selbst nach zweiter Generation nachweisbar, dass semikonservativ sein muss
- Auftrennung der DNA
Replikationsinitiation
Replikon-Modell
- Initiation benötigt
- Replikaitonsursprung
- Replikaitonsinitiator
Struktur von Replikatoren (ORIs –> Origin of Replication)
Replikaitonsursprung
- 2 Typen von Elementen
- Erkennungsstellen für DNA Binde-Proteinen (grün), 9-mer
- wo eigentliche Initiation beginnt (blau), 13-mer
- AT-reich (nicht so stabil wie GC)
Initiation der DNA-Replikation in e.coli
(a) DnaA-ATP erkennt 9-mer
* ATP gebunden hohe Aff. für Zielseq
(b) Konformationsänderung
- DNA biegt
- Torsionskräfte
- Aufschmelzen der 13mere (instabil AT-reich)
(c) DnaB und DNAC Helicase aktiviert
- Helicase zerlegt Doppelstränge
- ATP verbrauch
(d) nehmen Stränge auseinander
(e) Primase produziert RNA-Primer
Initiation der DNA-Replikation in e.coli II
(f) DNA Polymerase III holoenzym
- 2 katalytisch aktive Einheiten
- versch UE
- beide Richtungen
(g) 5’-3’ Richtung
(h) Kettenverlängrerung
Komponenten des Replikaitonsapparats
- DNA-Helicase
- DNA-abhängige RNA-Polymerase: Primase
- DNA-abhängige DNA_Polymerase Pol III
Helicase Wirkungsweise
- unter ATP-Verbrauch
- Trennung beider Stränge
- Kristallstruktur
- Hexagonaler Ring
- strukturelle Assymmetrie
- UE
- 6 unterschiedliche ATP bindende Stellen
- 2 ATP
- 2 ADP + P
- 2 leer
- shift von Konformationen
- 6 unterschiedliche ATP bindende Stellen
DNA-abhängige RNA-Polymerase: Primase
- initiiert DNA Synthese durch RNA Primer, der von Primase synthetisiert wird
- Primase synthetisiert RNA Primer
- 1 pro sek
- Primer sind 11 bp
- macht viele Fehler
DNA-abhängige DNA-Polymerase Pol III
- trägt eigentliche Polymerisierungslast
- extrem effizient
- innerhalb 30 min ganzes e.coli Genom repliziert
DNA Polymerasen in E.coli
welche Polymerase am seltesten?
- DNA Polymerase III
- 10-20 Moleküle
- nur ein Molekül um eine DNA zu replizieren
Biochemie der DNA-Polymerasen
Die durch DNA-Polymerase katalysierte Strangverlängerung
- Nucleophiler Angridd des 3’OH Primer-Endes auf das alpha-Phosphat des freuen Nucleotids
- Bildungeiner Phosphodiester Bindung
- Freisetzung von Pyrophosphat
DNA Polymerase III Struktur
- viele UE
beta-Untereinheit
- Prozessivität
- Ringmolekül
- aus 2 UE
- auf DNA geladen
- Ringklemme der zwei UE
- verhindert Runterfallen
Beladung der Sliding Clamp, Ringklemme
- ATP-Verbrauch
Zwei Polymerase III Moleküle sind an der Replikationsgabel miteinander verbunden
Korrekturfunktion
- reduziert Fehlerrate >1000 fach
- Korrektur per 3’-5’ Exonukleaseaktivität von DNA Polymerase III
- Genauigkeit:
- wie häufig macht Replikationsenzym Fehler?
- alle 10 000 000 bp
- Epsilon UE
Lagging Strand
- Folgestrang verläuft 5’-3’
- Polymerase in 3’.5’-Richtung
- okazaki fragmente
- Ligase verknüpft
Lagging Strand Synthese
a) RNA oligonukleotide (primer) wird von DNA kopiert
b) DNA Polymerase elongiert RNA Primer mit neuer DNA
c) DNA-Pol entfernt 5’RNA am Ende des benachbarten Fragments und
d) DNA Ligase verknüpft benachbarte Fragmente
Wie könnte man das Problem der Replikation lösen?
- kein antiparalleler Strang
- andere Chemie, die erlaubt in andere Richtung zu lesen
- einzelsträngige DNA
Replikationsgabel
loop
DNA Polymerase I in e.coli
- kann in beide Richtungen abbauen
- Synthese nur in 3’-5’-Richtung aufbauen
- Klenow-Fragment
- DNA-Polymerase
- 3’-5’Exonuclease
Funktion der 3’-5’ Exonuklease von Pol I
- nur ungepaarte Nukleotide am 3’-Ende werden entfernt
- Radioaktivität verschwindet
- radioaktiv markierte Templates (TATA)
- bei Inkubation des Enzyms mit Template, radioaktivitaet bleibt erhalten
- falsch gepaarte radioaktive Templates
- bei Inkubation mit Enzym Pol I werden schnell entfernt
- Nur ungepaarte Nukleotide am 3’-Ende werden entfernt
Warum gibt es nur 5’-3’-Kettenverlängerungen?
- energetische Bindung fehlt
Die 5’-3’ Exonuklease Aktivität von Pol I
- Polymerase entfernt den Primer
- Auffuellen des Strangs
- Ligase
- NAD Cofaktor,
- Anhaenung AMP, energetische Gruppe
- Attacke
DNA-Ligase
- Basenpaarung führt zu antiparallele Anordnung der DNA-Einzelstränge
- Problem bei Neusynthese an gleichen Initiattionspunkt
- Keine kontinuierliche Synhese möglich
- Teilstücke (<1000 bp) Okazakifragmente
- Kovalente Bindung
DNA Replikation in E.coli (Genom ca. 4 x 106 bp)
- Replikation wird an oriC initiiert
- Replation dauert ca. 40 min
- Pol III synthetisiert 1000 Nucleotide/Sekunde
- Pol I synthetisiert ca. 10 Nukleotide/Sekunde
- Primase synthetisiert ca. 30-60 Nucleotide/Sekunde
Teilung e.coli 20 min, Replikation e.coli 40 min! How?
- 2 Replikationsgabeln!
- in schnellwachenden e.coli Zellen beginnt eine neue Runde der Replikation bereits vor dem Ende der Zellteilung
*
(!) Wie OriC stillhalten?
- Replikationsursprung ori: GATC x 11
- DAM Methyliert am A
- nach Replikation ist A nur am parentalen Strang methyliert (hemimethyliert)
- nur wenn doppelt methyliert kann DnaA-protein binden
-
DnA-ATP
- bindet an ORI, leitet Aufspaltung ein
- unter Spaltung ATP
- DnaA-ADP nicht in der Lage ORI wieder anzufeuern
- Vorgang ADP zu ATP langsam
- DnaA-ATP bindet noch an zwei andere Seq-Elemente der DNA
- Gensequenz fuer DnA-Protein auf Chromosom, hat auch Promotor, im Promotor GATC, Dna-ATP bindet an eigenen Promotor und wirkt reprimierend → autoregulatorisch
- eine Gensequenz mit 5 Bindestellen für DnaA-ATP (datA) → reduziert die Konzentration von DnaA-ATP
Replikationsmodus: Rolling-Circle-Replikation
Multiple Replikationsursprünge - Replikation eukaryotischer Chromosomen
- 25 000 ori s
- Euchromatin mehr Ori s als Heterochromatin
- jedes Chromosom trägt viele Origins
*
Termination der Replikation
- An Terminatorsequenzen, die von Tus-Proteinen gebunden werden
- Terminationssequenzen, an die Proteine binden, die Helicase inhibieren, sind in einer best. Reihenfolge
- Ringe Verhaken sich → Concatemere, werden von Topoisomerase II aufgelöst
Minimalwissen
- Enzyme der Replikation
- Wie wird Replikation initiiert? Wie ist die Initiation reguliert?
- Was sind Okazaki-Fregmente?
- Wie sieht die Replikationsgabel aus?
- Wieso werden Nukleinsäuren immer in 5’-3’-Richtung verlängert?
Replikation in Eukaryoten: multiple Replikationsursprünge
- mehrere Replikationsgabeln
- 25000 oris
Replikation in Eukaryoten: multiple Replikationsursprünge
- mehrere Replikationsgabeln
- 25000 oris
- 8 stunden dauert replikation
- urspruenge mit autoradiogramm sichtbar machen., neu synthetisierte stellen sichtbar
Wechsel Polymerasen in Eukaryoten
- DNA Pol alpha/ Primase kann RNA Primer synthetisieren und DNA
- DNA Pol delta und epsilon sind aber schneller
- kommen nach
Regulation der Replikation in Eukaryoten
- Während der S-Phase muss die gesamte DNA 1x repliziert werden
- es darf keine Regionen geben, die unrepliziert bleiben
- führt zu Chromsomenbr¨chen während der Segregation
- es darf keine Bereiche geben, die mehrmals repliziert wurden
- führt zu Kopezahleffekten
- Bei großen Zahl von Replikationsursprüngen:
- wie kann dies gewährleistet werden?
Wie kann die große Zahl von Replikationsursprüngen reguliert werden ( also nicht zu viel Replikation?)
- Replikatoren (oris) werden durch die Replikation inaktiviert
- Wenn ORI gefeuert wurde dann ist ORI nicht mehr in der Lage Replikation zu initiieren
- Weil an Zellzyklus Faktoren (Cdks) gekoppelt ist
- Bildung des Präreplikativen Komplex (pre-RC) ist abhängig von diesen Zellzyklusfaktoren
Formierung des Präreplikativen Komplexes
- pre-RC
- Assemblierung ORC auf ORI
- ORC Origin Recognition Complex (6 Proteine), ist während des gesamten Zellzyklus an Origin gebunden
- Platform für weitere Komponenten
- Cdc6 und Ctd1 sind Helicase-loading Proteine, die Bindung an ORC erfolgt in G1 → “Licensing Factor”
- Licensing Factor oder auch Der Mcm2-7 Komplex ist die Replikationsgabel-Helicase
- Dieser Komplex entsteht in G1, wird aber erst aktiv in der S-Phase
Cyclin-abhängige Kinasen aktivieren die Replikation zellzyklusabhängig
- Kinasen selber entscheiden ueber ihre Kinaseaktivitaet
- Kinasen sind Enzyme die ueber ATP-Verbrauch Phosphorylierungen durchfuehren
- Phosphorylierungen veraendern eigenschaften Proteine
- Cycline sind kleine Proteine
- fungieren als Schalter für Kinasen
-
niedrige Aktivität der Kinase:
- pre-RC-Formierung erlaubt
- Aktivierung nicht erlaubt
-
hohe Aktivität der Kinase
- pre-RC-Formierung inhibiert
- Aktivierung existierender pre-RC
Cyclin-Aktivitaet waehrend des Zellzyklus
- G1: niedrig, Assemblierungsphase, pre-RCs werden geformt
- S Phase: Cyclin Konzentration hoch, Aktivierungsphase, Helicase und Polymerase machen ihren Job, Verdopplung der pre-RC,
- G2: pre-RC schrumpft
- M: Verdopplung in Zellteilung, Mitosephase
Cyclin Konzentrationen während des Zellzyklus
- verschiedene Signalproteine akkumulieren zu unterschiedlichen Zeitpunkten
- Interagieren dann mit Kinase (als Kofaktor mehr oder weniger)
- andere Cycline aktivieren andere Kinasen
- zu best. Zeitpunkten im Zellzyklus
- je nachdem welche Cycline da sind und welche Kinasen da sind
- Set von Proteinen aktivieren u.a. Licensing Faktoren
Termination: das Probelm an Chromosomenenden
- Lagging strand kann am Telomerende nicht vollständig repliziert werden
- ein Chromosom verkürzt sich
*
Telomerase
- fuegt kurze repetitive Sequenzen an das 3’ Ende an
- Telomerase ist eine Reverse Transkriptase (=RNA-abhaengige DNA-Polymerase mit einer eigenen RNA als Matrize)
*
Telomere
- Schutzkappen für Chromosomen
- machen Loops, da alles dieselbe Sequenz
- Selbsthybridisierung
- Schutz vor Exonukleasen
- Schelterin: Proteine fuer Stabilisierung
→ dienen dem Schutz der Chromosomen
Telomerase Regulation
- Die Telomerase ist in somatischen Zellen nicht oder wenig aktiv. hier verkürzen sich die Telomere tatsächlich
- In der Keimbahn, in Stammzellen und in Tumorzellen ist die Telomerase dagegen aktiviert
