ukupni proteini u serumi Flashcards
u kom obliku se nalaze proteini u serumu
u vidi kompleksne smese
kako se proteini klasifikuju
na osnovu
hemijskih osobina
katalitickih sposobnosti
imunoloskih osobina
funkcije proteina
nutritivna
kontrola distribucije vode
transportna funkcija
funkcija koagulacije
zastitna funkcija
funkcija pufera
funkcija enzima
uzorci za odredjivanje proteina
SERUM
urin
likvor
amnionska tecnost
saliva
feces
peritonealna i pleuralna tecnost
metode za odredjivanje proteina u telesnom tecnostoma
- odredjivanje konc ukupnih prot i albumina
- elektroforetkso razdvajanje, pri cemu semikvantitativno odredjujemo glavne klase proteina
- imunohemijsko odredjivanje specificnih proteina
kako odredjujemo Ag-At kompleks
nefelometrijski
turbidimetrijski
radijalnom imunodifuzijom RID
elektroimunodifuzijoom
kako cemo odrediti Ag-At kompleks koji je prisutan u jako maloj koncentraciji
radio imunoesejom RIA
enzimskim imunoesejom
kako cemo da detektujemo i odredimo konc abnormalnoh proteina
radijalnom imunodifuzijom
imunoelektroforezom
imunofiksacionom elektroforezom
metoda po kjeldalu
To je metoda u kojoj se vrsi digestija proteina kiselinom kako bi se azot iz proteina pretvorio u amonijum jon.
Zatim se konc azota u amonijaku odredjuju TITRACIJOM ili NESLERIZACIJOM.
Sadrzaj azota u proteinima je 16% pa se dobijena vrednos pomnozi sa 6.25 (100/16)
Ovom metodom se istovremeno odredjuje i neproteinski azot, pa je neophodno izvrsiti precipitaciju proteina.
Problem metode je vreme
REFERENTNA METODA(definise ref standard za biuretsku)
Biuretska metoda
-za odredjivanje koncentracije ukupnoh proteina u plazmi ili serumu
-zasniva se na reakciji karbonilnog kiseonika i azota amida peptidne veze sa jonom bakra u alkalnoj sredini pri cemu nastaje obojeni helat
-biuretska reakcija je specificna za jedinjenje sa NAJMANJE DVE PEPTIDNE VEZE
- jedan joj bakra vezuje se koordinativnim vezama sa sest susefnih peptidnuh veza
-boja helatnog kompleksa je ljubicasta a intenxitet proporcionalan broju peptidnih veza koje reaguju to jest broju molekula proteina u reakcionom sistemu
sastav dva najcesce koriscena biuretska reagenda
0.1-0.2M NaOH i 10/30M CuSO4
0.5M NaOH i 4-6M CuSO4
da bi reagens bio stabilan potrebno je dodati i K i Na tartarat da se jon bakra u baznoj sredini ne bi istalozio kao CuOH2
-dodaje se i KI koji sprecava autoredukciju alkalnog Cu tartarata i stvaranje Cu2O
koja je linearnost biuretske reakcije
10-120 g/l
ata ometa biuretsku reakciju
hiperbilirubinemija
lipemija
blaga hemoliza
- koriguju se upotrebom SP sa belim biuretom( bez cuso4)
-hemoliza izaziva povecanje proteina za 3% na svakig 1g/l hemoglobina u uzorku
koncentracija proteina u plazmi VS u serumu
u olazmi je visa za 2-4g/l zbog fibrinogena
kako se cuvaju plazma i serum
-stabilni su 7 dana na sobnoj
-mesec danna u frizideru
-dva meseca na -20
kalibracija biuretske metode
-govedji ili humani serumski albumin
zasto se albumin koristi kao standard
on je po sastavu jefnostavan ili prost protein
-kolicina azota je konstantna
-broj peptidnih veza je poznat
-lako se dobija albumin velike cistoce
-govedji je jeftiniji
-humani sporije reaguje od govedjeg pa tehnike koje mere inicijalnu brzinu moraju biri standardizovane humanim
na cemu se zasniva odredjivanje proteina spektrofotometrijski na 280nm
-na apsorpciji specificnih proteinskih veza koje sadrze aromaticna jezgra aminokiselina TIROZINA TRIPTOFANA I FENILALANIN
-apsorbancija zavisi od prisustva ovih ak ali i mokra ne kiseline i bilirubina u serumu jer i oni apsorbuju
-jednostavna i osetljiva metoda, ali zahteva upotrebu UV spektrofotometra
-nespecificna za proteine, odredjuje jedinjenja sa aromaticnim ak, same ak i odg peptide
-tacna i osetljiva za relativno preciscene proteinske rastvore (eluiranje ili frakcionisanje)
odredjivanje proteina folin kiokalteuovom metodom
zasniva se na redukciji folin kiokalteuovog reagensa( fosfovolframova i fosfomolibdenska kis) u prisustvu ak tirozina i triptofana koje poticu i proteina pri cemu nastaje plavi kompleks koji se meri spektrofotometrijski
-pogodnija za odredjivanje konc pojedinacnih proteina jet svaki protein sadrzi tcno odredjenu kol ovih arom ak
koji je najosetljiviji postupak za odredjivanje ukupnoh proteina
-modifikacija lorijeve metode
- lorijeva metoda se zasniva na pretretmanu uzorka alkalnim rastvorom bakra a onda se dodaje folin kiokalteuov fenolni reagens
-boja nastaje redukcijom foafovolframove i foafomolibdenske kis pod dejstvom kompleksa bakar-peptidna veza iz tirozina i triptofana u proteinima
-jako pogodna za odredjivanje ukupnih proteina u maloj kolicini bioloskog materijala
koje su prednosri folin kiokalteuove metode a koje mane
-prednost je to sto je osetljivija 100 puta od biuretske i 10 puta od spektrofotometrijskog odredj na 280nm
-jqko je pogodna za odredjivanje ukupnih proteina ako imamo malo bioloskog materijala ili malu koncentraciju proteina u materijalu
-mana je sto se ne koristi za odredjivanje proteina u urinu i likvoru jer reagensi deluju nespecificno sa ne proteinskim komponentama sto je veci problem u likvoru i daju pozitivnu gresku
-zbog male specificnosti i dosta interferencija ne koristi se u rutinskim lab
-oba reagensa su nestabilna i imaju kratak rok upotrebe
turbidimetrijsko odredjivanje konc ukupnih proteina
-vrsi se nakon precipitacije : sulfosalicilnom kis, sulfosalicilnom kis sa natrijum sulfatom, sulfosalicilna kis u trihlorsircetna, samo trihlorsircetna
-talozne metode se zasnivaju na stvaranju precipitata ukupnih proteina koje rasprsuju inicijalnu svetlost.
-PREDUSLOV ovog odredjivanja je da se postignu uslovi reakcije pod kojima se jednako uspesno taloze j albumini i globulini
-neophodno je postici homogenu raspodelu suspendovamih cestica tokom merenja
-potrebno je izabrati dobar standard sa istim precipitirajucim osobinama ko proteini plazme
odredjivanje proteina u urinu
vrai se turbidimetrijskom metodom nakon precipitiranja uzorka sa trihlorsircetnom kiselinom, pri cemu se supernatant dekantuje a precipitat rastvara biuretskim reagensom
-ne koristi se za likvor jer je potrebna velika kol uzorka
metode koje se zasnivaju na vezivanju boje za proteine
-koriste se kod elektroforeze za bojenje razdvojenih frakcija proteina i odredjivanje konc albumina i protrina u urinu i likvoru
-boje: Amido Black, Ponceau S, coomassie brilliant blue (CBB)
- nedostatak je nejednak afinitet i vezujuci pacatitet pojedinih proteina kao i nemogucnost nalazenja odg standarda
-za analizu proteina u urinu i likvoru CBB
-CBB se vezuje za protonizirane amino grupe ostataka ak u polipeptidnim lancima sto dovodi do pomeranja apsorpcionoh maks
