elektroforetsko razdvajanje proteina u serumu Flashcards
sta je elektroforeza i kako se primenjuje za razdvajanje proteina
-elektroforeza je kretanje naelektrisanih cestica u elektricnom polju.
-pod dejstvom el polja negativne cestice se krecu ka pozitivnoj anodi a pozitivne ka negativnoj katodi
-proteini imaju nalektrisanje koje potice od bosnog lanca aminokiselina koje ih grade
-negativno naelektrisane grupe u alkalnoj sredini : karboksilna (asparginska i glutaminska kis) - u kis sredini su neutralne
-pozitivno naelektrisanje u kiseloj sredini : amino grupa (histidin, lizin, arginin)- u alkalnoj neutralna
sta je IT
-IT je izoelektricna tacka odnosno pH vrednost pri kojoj je ukupno naelektrisanje nekog proteina jednako nuli
-sto je veca razlika izmedju pH i IT vece je i naelektrisanje
kako se obezbedjuje pH u elektroforezi
-puferom, ugl barbituratni ili TRIS-barbituratni sa Ca laktatom, pH=8,6
-uglavnom se koristi jedan pufer pa je to kontinuirani sistem ali moze i vise pufera da se koristi pa da bude diskontinuirani sistem
-barbituraatni pufer je izbor jer ne precipitira i ne denaturise proteine
-Provodljivost pufera zavisi od jonske jacine koja je obicno 0,05-0,15
-koncentrovaniji puferi daju ostrije frakcije
-sa povecanjem jonske jacine povecaava se i jacina struje pa razdvajanje treba da se vrsi pri nizem naponu sto traje duze
sta je elektroendoosmoza
-elektroforeza se izvodi na razlicitim medijumima koji u vecini slucajeva imaju negativno naelektrisanje usled potencijala koji postoji na dodirnoj povrsini izmejdu medijuma i pufera
-neki od medijuma sadrze i negativno naelektrisane grupe u alkalnim sredinama (papir-karpoksilna, agar-sulfatna)
-negativno naelektrisani joni imaju tendenciju da putuju prema anodei ali je to nemoguce jer se nalaze u stacionarnom medijumu. Da bi se uravnotezila sila koja ovime nastaje pozitivno naelektrisan molekul vode putuje katodno
-oa pojava se naziva elektroendoosmoza
-kao posledica katodnog kertanja vode, elektroneutralni molekuli se pomeraju blago katodno a svi anjoni su nesto usporeni u kretanju ka anodi
medijumi za razdvajanje samo na osnovu naelektrisanja
-papir
-celuloza acetat
-agarozni gel
-razdvajaju 5 frakcija
efekat molekularnog rasejavanja
skrobni gel
poliakrilamidni gel
-mogu da razdvoje 25 frakcija
papir
-istorijski znacaj
-nema homogenu velicinu pora
-ima izrazen efekat elektroendoosmoze
-moze da adsorbuje proteine sto smanjuje ostrinu frakcija
celuloza acetat
-najbolji medijum za jednostavno i brzo svakodnevno razdvajanje iz seruma i urina
-velicina pora homogena
-adsorpcija minimalna
agar gel
-bolji od papira losiji od skrobnog i poliakrilamidnog gela
-prirodni agar sadrzi agaropektin koji je negativno naelektrisan pa je elektroendoosmoza jako izrazena, a moze doci i do adsorpcije
-danas se koristi PRECISCENA AGAROZA koja sadrzi mnogo manji broj jonizovanih grupa pa je elektroendoosmoza znacajno smanjena
-koristi se rutinski sa celuloza acetatom
skrob gel
-sastoji se od amiloze i amilopektina
-za ovo se koristi parcijalno hidrolizovani skrob, razdvajaju se granule amiloze i amilopektina i zagrevanjem, kljucanjem i hladjenjem suspenzije skroba u puferu dobija se cvrsti gel
-proteini se krecu kroz mrezu amilopektina cije su pore iste velicine kao i proteinski molekuli i dolazi do molekulskog prosejavanja
-razdvajaju se i povelicini i obliku
-sastav skroba moze znatno da varira pa se za svaku seriju hidrolizovanog skroba mora odrediti i optimalna konc
-PRIMENA: istrazivanje polimorfizma proteina i izoenzima
poliakrilamidni gel
-mozemo sami da kreiramo velicinu pora
-jedini ima reproducibilnu pripremu
-nema naelektrisanja pa je efekat elektroendoosmoze zanemarljiv
kakav napon i jacinu struje koristimo
-koristi se ili konstantan napon ili konstantna jacina
-ne mogu se odrediti teorijski vec empirijski i dosta variraju
-elektroforeza na agaroznom gelu se vrsi pod konstantnim naponom i promene u struji i temp nisu problem
zasto skracujemo vreme elektroforeze i kako
-pozeljno da je vreme sto krace kako bi dobili ostrije razdvojene trake
-to se postie skracenjem medijuma ili povecanjem napona
-ako povecavamo napon moramo da koristimo pufer sa manjom jonskom jaacinom kako ne bi doslo do pregrevanja i denaturacije proteina
koje se boje koriste
-organske boje: AMIDO BLACK, CBB, BROMFENOL PLAVO, PONCEAU S
-srebro
-fluorogena detekcija
-amido black se koristi za agarozu
-ponceau s se koristi za celulozu acetat
-cbb se koristi za poliakrilamid i ona je najosetljivija
-srebrose zbog svoje osetljivosti koristi i za likvor
sta se radi posle bojenja
-denzitometriranje
-grubo kvantitativno odredjivanje proteina
-patoloska promena moze da se vidi i vizuelno jer se uvek pusta pored uzorka jedan kontrolni radi poredjenja
-patoloski uzorak se dalje ispituje imunohemijski
