Microscopie Flashcards
en MO observation de
tissus, cellules, hématies, bactéries
≠ MO
microscopie conventionnelle
à fluorescence
confocale
résolution MO (conventionnelle et à fluorescence)
10mm - 200nm
en ME observation de
cellules, organites (ribosomes, mitochondries, lysosomes, noyaux), virus, atomes et molécules
≠ ME et résolution
MET
MEB
résolution: 100µm - 10nm
en microscopie à sonde locale obs de
prot, aa, ADN/ARN, atomes
≠ microscopie à sonde locale
AFM: microscopie à force atomique → 10nm-1nm
STM: microscopie à effet tunnel → 10nm-0,5nm
amplitude
la distance entre une crête ou un creux et la position de repos
longueur d’onde
cycle
distance entre 2 crêtes consécutives
longueur d’onde augmente →
fréquence diminue
énergie diminue
résolution diminue
longueur d’onde croissante
rayons gamma < rayons X < UV < lumière visible < IR < micro-ondes < ondes radio et TV
lumière bleue (λ =488nm) par rapport à lumière rouge (λ=650nm)
+ grande fréquence
transporte + d’énergie
résolution sup
image observée en 2 temps
image réelle créée par objectif
image virtuelle créée par oculaire
lentilles
lentilles de l’oculaire
lentilles du condenseur de type Abbe
lentilles de l’objectif
lentilles de l’oculaire
lentille oculaire lentille du diaphragme lentille du champs projettent l'image sur la rétine = oculaire Huygenien grossissement X5 - X10
lentilles du condenseur de type Abbe
organisées en doublet ou en triplet
concentration lumière sur l’échantillon/ le spécimen
processus de correction des aberrations optiques
lentilles de l’obj
comprennent un ménisque et le lentilles hémisphériques frontales (tout en bas)
processus de correction des aberrations optiques
organe le + important du microscope
grossissement X0,5 - X100
microscopie à (épi)fluorescence
résolution de même ordre que microscopie conventionnel (10mm-200nm)
source de lumière = lampe à Xe ou Hg
présence de filtres et de miroirs
mise en jeu fluorochromes
fluorochromes
possèdent souvent
- structures cycliques aromatiques
- résidus tryptophane (indole)
FITC
fluorochrome lumière verte
déplacement de stokes ~ 30nm
immuno-fluo
le + souvent fluorochromes sont exogènes = introduits dans le tissu par les AC (couplés à des fluorochromes, spé pour le tissu examiné)
déterminer la loc. tissulaire d’un épitope (aka site Ag)
immuno-fluo directe
Ac primaire couplé avec le fluo
l’Ac primaire reconnait l’épitope (aka site Ag)
immuno-fluo indirecte
Ac secondaire couplé avec le fluo
l’Ac secondaire reconnait le fragment Fc de l’Ac primaire → amplifie le signal
fluorochromes émettent photon (signal) après excitation
photon de longueur d’onde donnée est absorbé
e- passe sur orbital d’énergie sup
e- repasse sur orbitale initiale: accompagne l’émission d’un photon d’énergie inf à celle du photon absorbé
déplacement de Stokes aka stockes shifts
= l’écart entre la longueur d’onde du pic d’émission et celle du pic d’absorption
longueur d’onde émise est + grande que celle de l’onde absorbée
chaque fluorochrome: spectre + pic d’excitation et spectre + pic d’émission
filtres low pass
laissent passer ondes avec longueur inf. à une valeur donnée
filtres high-pass
laissent passer ondes avec longueur sup. à une valeur donnée
filtres band pass
laissent passer ondes avec longueur comprise dans intervalle donné
ex filtre d’excitation destiné à exciter un fluo. par une lumière bleue pour obtenir signal vert
filtres d’excitation passe bas: laisse passer que ondes bleues
miroir dichroïque dévie les ondes bleues vers échantillon
ondes bleues excitent FITC
miroir dichroïque laisse passer ondes vertes émises vers l’oculaire from FITC
ondes vertes arrivent jusqu’au capteur
marquages w/ couples de fluo.
pics d’émissions éloignés: marquage double
pics d’émissions très rapprochés: pas de distinction entre signaux émis (impossible à lire)
marquage de fibroblastes en culture
noyaux → DAPI (bleu)
actine → FITC (vert)
tubuline des MT → Texas Red (rouge)
fluorochromes d’origine transgénique
gène codant pour une prot fluo. d’origine naturelle est fusionnée avec le gène codant une autre prot
construction introduite dans des cellules
distribution et dynamique de la prot d’intérêt taguée peut être observée car la prot de fusion obtenue est fluo
GFP (prot fluo verte)
première prot fluo découverte
prix Nobel 2008
GloFish
gènes de prot fluo sont sous le contrôle du promoteur du gène codant pour de chaînes légères de la myosine (prot µ)
Brainbow mouse
explorer connectivité du cerveau
mélange de 4 fluorochromes ≠ → 100 nuances
réfraction
fléchissement de l’onde par lentille
interférence
sommation des amplitudes de 2 ondes “après” la lentille: constructive/ destructive
diffraction
création d’ondelettes secondaires par l’obstacle
lentille convergente: angle de déviation
+ important
- pour les ondes éloignées du centre
- pour les ondes courtes
convolution
modification du signal par un système optique
équation rayon de la PSF
r = 1,22λ /2NA
équation de l’ouverture numérique
NA = n x sinµ
équation D
plus D est petite plus la résolution K est bonne
D = 0,61λ /NA
λ des électrons MET
λ = h/mv
prix nobel de chimie 2014
microscopie à fluo à nanodimension
Eric Betzig, William Moerner, Stefan Hell
découverte e-
prix nobel 1906
Joseph John Thompson
établie nature ondulatoire des e-
prix nobel 1929
Louis de Broglie
découvre constante de Plank
prix nobel 1918
Max Plank
1er MET
Ruska, Berlin 1932
résolution max MET
0,1 nm (0,07 nm en 2006)
résolution max MEB
1-5nm
canon à électrons
- filament = cathode, émission thermoionique des e- (2700°C)
- cylindre de Wehnelt: concentre e- vers l’axe central
- anode: accélère les e-
- faisceau d’e- accéléré et projeté du sommet de la colonne vers échantillon
lentilles électromagnétiques
- création champ magnétique:
déforme et fait tourner FE
change distance focale
assure cohérence du FE - défauts: déformables, imparfaites, sujettes à des aberrations
- changement de leur épaisseur: changer distance focale
détecteur d’Everhard-Thornley
capte e- secondaires
e- captés sont transformés en photons transmis dans un analyseur: photomultiplicateur
