LABORATORIAL Flashcards
A figura abaixo mostra um gráfico do tipo dot plot dos parâmetros Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC) obtido por citometria de fluxo de sangue periférico. Qual a população representada pelas células VERDES?
LINFÓCITOS
A interpretação dos dados obtidos por citometria de fluxo é baseada na estratégia de definição de GATES, o que permite caracterizar subpopulações e analisar suas características específicas.
Inicialmente, as células são representadas conforme a dispersão da luz que incide sobre elas.
O primeiro parâmetro utilizado é o Forward Scatter (FSC), que corresponde à dispersão FRONTAL da luz e está diretamente relacionado ao TAMANHO da célula, seguindo a ordem CRESCENTE:
-Hemácias e debris celulares < linfócitos < granulócitos < monócitos.
O segundo parâmetro é o Side Scatter (SSC), que corresponde à dispersão LATERAL da luz e diretamente associado à COMPLEXIDADE da célula. Seu valor é maior em células que possuem grânulos ou núcleo irregular e segue a seguinte ordem CRESCENTE:
-Hemácias e debris celulares < linfócitos < monócitos < granulócitos.
No gráfico mostrado, temos as seguintes populações:
- Hemácias e debris celulares: representados pela cor preta. Estão localizados na porção inferior esquerda, pois apresentam tamanho PEQUENO e BAIXA complexidade.
- Linfócitos: representados pela cor verde. São maiores que as hemácias, mas ainda assim PEQUENOS e POUCO complexos em relação às demais populações.
- Monócitos: representados pela cor azul. São as MAIORES células (maior FSC), porém MENOS complexas que os granulócitos.
- Granulócitos: representados pela cor vermelha. Correspondem às células com MAIOR complexidade (maior SSC) devido à alta granularidade de seu citoplasma.
Qual imunofenótipo deve ser considerado ANORMAL para um NEUTRÓFILO maduro?
A) CD117 negativo
B) CD16 positivo
C) CD10 positivo
D) CD15 negativo
CD15 NEGATIVO
O imunofenótipo do NEUTRÓFILO normal é caracterizado por:
- Marcadores positivos: CD45, CD13, CD10, CD11b, CD15, CD16, CD33, CD35, CD64 e CD65.
- Marcadores negativos: CD34, HLA-DR e CD117.
Dentre os marcadores positivos, se destacam:
- CD11b: Marcador associado a maturação granulocítica, que surge no final do estágio de promielócito.
- CD15: Surge no promielócito e aumenta progressivamente atingindo maior expressão no neutrófilo maduro.
- CD10: Apesar de ser uma marcador tradicional de linfócitos B imaturos ou no estágio de centro germinativo, também é encontrado em neutrófilos maduros.
- CD64: É um marcador típico de monócitos e macrófagos, mas pode ser expresso em neutrófilos no contexto de inflamação e ativação neutrofílica.
Qual marcador NÃO é expresso ao longo da maturação monocitária normal?
A) CD4
B) CD14
C) CD36
D) CD7
CD7
Na citometria de fluxo, podemos dividir a população monocitária em 3 estágios de maturação:
- Monoblastos;
- Promonócitos; e
- Monócitos maduros.
Os monoblastos podem ser identificados na gate inicial CD45 versus SSC como células imaturas que apresentam BAIXA expressão de CD45.
Em seguida, utilizamos os marcadores CD34, CD13, CD33 e CD117 para definir uma população mista constituída por mieloblastos e monoblastos, que não podem ser adequadamente diferenciados neste estágio do desenvolvimento.
Para identificação dos promonócitos, observamos o desaparecimento gradativo dos marcadores de imaturidade CD34 e CD117, aumento progressivo da expressão de CD13 e CD33, surgimento dos marcadores CD11b, CD64, CD15 (com expressão fraca) e CD14 (que se tornará mais intenso ao final da maturação).
Precedendo o aparecimento de CD14 no promonócito, pode-se observar a expressão de CD36 e CD4 (marcador típico de células T, mas que surge com intensidade fraca nesse estágio).
Em seguida, no monócito maduro, ocorre aumento da expressão de CD14 e surgimento dos marcadores adicionais CD35 e CD300e.
Diferente dos granulócitos, as células monocitárias expressam HLA-DR durante toda sua maturação.
Key Points:
- Os monoblastos apresentam o seguinte fenótipo: CD45dim, CD34 positivo, CD117 positivo, CD13 positivo e CD33 positivo, semelhantes aos demais blastos mieloides;
- Os promonócitos adquirem progressivamente o fenótipo: CD34 negativo, CD13 positivo forte, CD33 positivo forte, CD64 positivo e CD15 positivo;
- Os marcadores CD36 e CD4 surgem no promonócito logo antes da expressão de CD14.
Referências:
- Matarraz S, et al. Introduction to the diagnosis and classification of monocytic‐lineage leukemias by flow cytometry. Cytometry Part B. 2017.
Abaixo mostrado um estudo de imunofenotipagem por citometria de fluxo em medula óssea. Neste caso, qual cor representa a população de PROMONÓCITOS?
A) Roxo
B) Azul
C) Verde
D) Amarelo
ROXO
O comprometimento das células-tronco hematopoéticas CD34 POSITIVAS com a linhagem MONOCÍTICA se manifesta com AUMENTO progressivo da expressão de CD64 e PERDA de expressão de CD34.
Essas alterações ocorrem PRECOCEMENTE e estão associadas à manutenção da expressão de FORTE intensidade do HLA-DR, down-regulation do marcador CD117 e aquisição do marcador CD36.
Outras linhagens celulares, como neutrófilos, eritrócitos e megacariócitos, apresentam perda CONCOMITANTE de expressão de HLA-DR e CD117 ao longo de sua maturação.
Dessa forma, os PROMONÓCITOS se caracterizam pelo seguinte imunofenótipo:
- CD64 positivo forte;
- HLA-DR positivo forte;
- CD34 negativo; e
- CD117 negativo.
Em sequência, ocorre expressão dos marcadores CD14, CD35 e, posteriormente, CD300 (IREM-2).
O imunofenótipo característico dos MONÓCITOS MADUROS é:
- CD64 positivo forte;
- HLA-DR positivo forte;
- CD14 positivo forte;
- CD35 positivo forte;
- CD300 positivo forte;
- CD34 negativo; e
- CD117 negativo.
Key Points:
- Os promonócitos apresentam expressão progressivamente maior de CD64 e gradativamente adquirem CD14 ao longo de sua maturação.
Referências:
- Matarraz S, et al. Introduction to the diagnosis and classification of monocytic‐lineage leukemias by flow cytometry. Cytometry Part B. 2017.
Referência da imagem:
- Aane CM, et al. Diagnostic Utility of Flow Cytometry in Myelodysplastic Syndromes. Front Oncol. 2016.
Homem, 32 anos, internado após acidente de moto, evoluiu com infecção de corrente sanguínea por S. aureus e fez uso de Oxacilina por 14 dias. Após o tratamento, evoluiu com neutropenia grave. Hb 13 g/dl, Neu 200/mm³ e Plq 320 mil/mm³. Mielograma identificou medula óssea normocelular para idade, com parada de maturação na série granulocítica e 30% de promielócitos. Colocação especial para mieloperoxidase foi FORTEMENTE positiva nessas células. Imunofenotipagem de medula óssea por citometria de fluxo identificou população granulocítica com CD13 heterogêneo, CD34 negativo e HLA-DR negativo. Expressão de CD117 e CD11b mostrada abaixo. Neste caso, qual a principal hipótese diagnóstica?
A) Agranulocitose
B) Leucemia promielocítica aguda
C) Leucemia mielomonocítica aguda
D) Anemia aplástica
AGRANULOCITOSE
Algumas características imunofenotípicas da medula óssea em RECUPERAÇÃO de um quadro de agranulocitose ou após qualquer agressão (como quimioterapia ou infecções graves) são SEMELHANTES às observadas em pacientes com leucemia promielocítica aguda, incluindo o padrão de expressão dos marcadores mieloides CD13 e CD33 e a AUSÊNCIA de expressão de CD34 e HLA-DR nos PROMIELÓCITOS.
Nesses casos, a expressão dos marcadores CD117 e CD11b pode auxiliar no diagnóstico diferencial:
- Leucemia promielocítica aguda: CD117 positivo e CD11b negativo;
- Medula óssea em recuperação: CD117 negativo e CD11b positivo.
Key Points:
- Diferente da leucemia promielocítica aguda, os promielócitos da medula óssea em recuperação são negativos para CD117 e positivos para CD11b.
Referências:
- Rizzatti EG, et al. Expression of CD117 and CD11b in Bone Marrow Can Differentiate Acute Promyelocytic Leukemia From Recovering Benign Myeloid Proliferation. Am J Clin Pathol. 2002.
Quais agonistas apresentam curva com padrão BIFÁSICO no teste de agregação plaquetária (mostrado abaixo)?
A) Trombina e ristocetina
B) ADP e epinefrina
C) Ácido aracdônico e colágeno
D) Colágeno e ristocetina
ADP E EPINEFRINA
O teste de AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA é um método capaz de avaliar a capacidade de ativação e agregação das plaquetas in vitro.
Algumas técnicas utilizam sangue total, mas a maioria das vezes se prefere PLASMA RICO EM PLAQUETAS.
A agregação plaquetária NORMAL in vitro apresenta resposta BIFÁSICA quando se utilizam os seguintes agonistas:
- ADP; ou
- EPINEFRINA.
A PRIMEIRA ONDA de agregação plaquetária reflete a ativação da integrina αIIbβ3 (previamente chamada de GPIIb/IIIa) e a consequente formação de ligações interplaquetárias por meio do FIBRINOGÊNIO.
A SEGUNDA ONDA reflete o fenômeno de DEGRANULAÇÃO plaquetária e o aumento da agregação inicial em resposta à liberação de diversos agonistas contidos nos grânulos plaquetários.
Os agonistas ácido aracdônico, colágeno, ristocetina e trombina provocam onda ÚNICA de agregação.
Key Points:
- No teste de agregração plaquetária, os agonistas ADP e epinefrina tem padrão de resposta bifásico.
Referências:
- Coutre S. Congenital and acquired disorders of platelet function. Uptodate. 2020.
Qual imunofenótipo NÃO é característico da leucemia linfoblástica de células B com t(12;21)/ETV6-RUNX1?
A) Ausência de CD9
B) Ausência de CD20
C) Ausência de CD13
D) Ausência de CD66c
AUSENCIA DE CD13
A leucemia linfoblástica de células B com t(12;21)(p13.2;q22.1)/ETV6-RUNX1 representa cerca de 25% dos casos de LLA B na infância, não ocorre no lactente e raramente acomete o adulto.
Tipicamente se apresenta com o imunofenótipo B comum, ou seja, com expressão de CD10.
Como característica, não expressa os marcadores CD9, CD20 e CD66c.
Marcadores associados à linhagem mieloide, por outro lado, são expressos com alta frequência, com destaque para o CD13.
Apresenta bom prognóstico, com taxa de cura superior a 90% na infância.
Na ocasião da recaída, costuma apresentar latência maior (ou seja, maior sobrevida livre de doença) em relação aos demais subtipos.
São marcadores de risco adicionais: idade acima de 10 anos e presença de leucocitose ao diagnóstico.
Key Points:
- A leucemia linfoblástica de células B com t(12;21)(p13.2;q22.1)/ETV6-RUNX1 é comum na infância e expressa frequentemente marcadores mieloides.
Foram encaminhadas amostras de sangue periférico de dois pacientes para pesquisa de hemoglobinúria paroxística noturna por citometria de fluxo. O resultado da marcação por FLAER na população de células CD15 positivas encontra-se representado abaixo. Neste caso, qual a interpretação do exame?
A) Presença de clone HPN em ambos
B) Ausencia de clone HPN em ambos
C) Presença de clone HPN em B
C) Presença de clone HPN em A
C) PRESENÇA DE CLONE HPN EM B
A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma doença adquirida da célula-tronco hematopoética devido mutação somática do gene PIG-A localizado no cromossomo X.
A proteína PIG-A está envolvida no estágio inicial da síntese da âncora de GPI (glicosilfosfatidilinositol), importante para a fixação de diversas outras proteínas na superfície celular.
Entre as proteínas ligadas ao GPI, destacam-se o CD55 (Decay Accelerating Factor, DAF) e CD59 (Membrane Inhibitor of Reactive Lysis, MIRL), essenciais para o controle da ativação do complemento na superfície dos eritrócitos.
Historicamente, o diagnóstico de HPN era feito pela pesquisa das moléculas CD55 e CD59 na superfície eritrocitária por citometria de fluxo, identificando-se as seguintes populações de eritrócitos:
- Tipo I: expressão normal;
- Tipo II: deficiência parcial;
- Tipo III: deficiência completa.
Posteriormente, a análise de marcadores adicionais tornou o diagnóstico de HPN mais sensível. Entre eles, destaca-se o FLAER (Fluorescein-Labeled Proaerolysin).
A técnica é baseada no princípio de que a proaerolisina (protoxina de aerolisina produzida pela bactéria Aeromonas hydrophila) é capaz de se ligar naturalmente à âncora de GPI.
A forma natural da proaerolisina provoca lise celular após se ligar ao GPI. Portanto, foi produzido uma variante recombinante sem capacidade de lise, mas que preserva sua especificidade de ligação.
O uso do FLAER é EXCLUSIVO para a população LEUCOCITÁRIA e consegue detectar até mesmo PEQUENOS clones HPN com tamanho de até 0,5%.
No estudo de citometria de fluxo mostrado, portanto, a pesquisa do FLAER na população granulocítica (CD15 positiva) identificou a presença de clone HPN (FLAER negativo) na amostra B.
Key Points:
- A presença normal da âncora de GPI pode ser identificada pela marcação positiva pelo FLAER;
- A utilização do FLAER aumenta a sensibilidade na pesquisa de clone HPN na população leucocitária.
Referências:
- Sutherland DR, et al. Diagnosing PNH with FLAER and Multiparameter Flow Cytometry. Cytometry Part B. 2007.
Referências da imagem:
- Kim H, et al. The first case of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and Budd-Chiari syndrome treated with complement inhibitor eculizumab in Korea. Blood Research. 2017.
Cerca de METADE dos casos de leucemia mieloide aguda podem expressar marcadores LINFOIDES anômalos. Dentre eles, qual o marcador expresso com MAIOR frequência?
A) CD10
B) CD2
C) CD5
D) CD20
D) CD20
Os antígenos mais frequentemente expressos em células de leucemia mieloide aguda são CD45 (97%), CD33 (95%) e CD13 (94%), seguidos de outros marcadores mieloides associados à linhagem granulocítica ou monocítica.
Cerca de METADE dos casos de LMA podem expressar marcadores linfoides anômalos, na seguinte ordem de frequência: CD20 (17%), CD7 (16%), CD19 (10%), CD2 (7%), CD3 (6%), CD5 (5%), and CD10 (3%).
Key Points:
- A presença de marcadores linfoides anômalos na LMA é frequente e pode ser útil para seguimento de doença residual mensurável.
Referências:
- William BA, et al. Antibody Therapies for Acute Myeloid Leukemia: Unconjugated, Toxin-Conjugated, Radio-Conjugated and Multivalent Formats. Journal of Review Clinical Medicine. 2019.
Menina, 6 anos, portadora de leucemia linfoblástica B com hipodiploidia, imunofenótipo do tipo comum, risco standard. Está em tratamento conforme protocolo GBTLI LLA-2009, atualmente na fase de manutenção. Avaliação de rotina com mielograma identificou a presença de 2% de blastos. Foi encaminhado material para pesquisa de doença residual mensurável por citometria de fluxo. O gráfico abaixo mostra os parâmetros CD38 e CD58 na população de células com expressão de CD19. Neste caso, qual a interpretação?
A) Ambas as populações apresentam fenótipo anômalo
B) Nenhuma população apresenta fenótipo anômalo
C) A população vermelha apresenta fenótipo anômalo
D) A população azul apresenta fenótipo anômalo
C) A POPULAÇÃO VERMELHA APRESENTA FENÓTIPO ANOMALO
A pesquisa de doença residual mensurável na leucemia linfoblástica B baseia-se na identificação de ASSINCRONIA DE MATURAÇÃO e expressão de MARCADORES ANÔMALOS.
Uma estratégia bastante informativa na gate de células CD19 positivas é a avaliação do padrão de expressão dos marcadores CD58 e CD38.
Nos linfócitos IMATUROS, deve haver expressão FORTE e homogênea de CD38, que reduz progressivamente ao longo da maturação linfocitária e volta a aumentar no estágio de plasmócito.
Já o CD58 é expresso com MAIOR intensidade pelo linfócito IMATURO e reduz sua expressão conforme a célula amadurece.
No blasto leucêmico, observa-se HIPEREXPRESSÃO de CD58 e expressão FRACA e HETEROGÊNEA de CD38.
No gráfico apresentado, a população identificada em VERMELHO deve ser considerada ANORMAL.
Key Points:
- Na LLA B, observamos perda da expressão de CD38 e hiperexpressão de CD58;
- A gate CD38 versus CD58 é bastante útil na pesquisa de DRM por imunofenotipagem.
Referências:
- Wood BL, et al. Flow cytometry in the diagnosis and monitoring of acute leukemia in children. Journal of Hematopathology. 2014.
Menino, 17 anos, encaminhado para investigação devido pancitopenia e dor óssea. Imunofenotipagem de medula óssea por citometria de fluxo mostrado abaixo. Neste caso, qual a principal hipótese diagnóstica?
A) Leucemia mieloide aguda sem maturação
B) Leucemia linfoblástica aguda early T
C) Leucemia aguda indiferenciada
D) Leucemia linfoblástica aguda T medular
B) LLA EARLY T
A leucemia linfoblástica aguda early T é uma entidade provisória definida na última classificação da Organização Mundial da Saúde e se caracteriza por uma população de células bastante imaturas e com diferenciação limitada para a linhagem T.
Corresponde a cerca de 10% dos casos de LLA T da infância e 5-10% dos casos de LLA T em adultos.
Os blastos são células com expressão fraca de CD45, baixo valor de SSC, expressão de CD3 citoplasmático e CD7. Raramente, pode haver expressão de CD3 na superfície.
Por definição, devem ser NEGATIVOS os marcadores CD8 e CD1a; e
POSITIVOS pelo menos um dos seguintes marcadores associados à linhagem mieloide e/ou à imaturidade: CD13, CD33, CD117, CD34, HLA-DR, CD11b e CD65.
Pode haver expressão de CD2 e/ou CD4.
O marcador CD5 geralmente é NEGATIVO. Mas quando presente, deve ser limitado a menos de 75% das células neoplásicas.
A mieloperoxidase e os marcadores definidores de linhagem B devem ser obrigatoriamente NEGATIVOS.
Key Points:
- A leucemia linfoblástica aguda early T pode ser caracterizada pela presença de cCD3, CD7, marcadores mieloides e marcadores de imaturidade;
- Apesar de ser uma célula imatura, a leucemia linfoblástica aguda early T pode expressar CD4, mas nunca CD8 ou CD1a.
Referências:
- The WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. 4th revised edition. 2016.
Mulher, 56 anos, previamente hígida, encaminhada para avaliação devido anemia e esplenomegalia. Hb 8,5 g/dl, GB 8.000/mm³, Neu 2.000/mm³, Ly 6.000/mm³ e Plq 130 mil/mm³. Estudo de imunofenotipagem por citometria de fluxo de sangue periférico mostrado abaixo. Tomografia com contraste de região cervical, tórax, abdome e pelve não identificou lesões nodais. Neste caso, qual a conduta recomendada?
A) Observação clínica
B) Tratamento com R-COP
C) Esplenectomia diagnóstica e terapêutica
D) Monoterapia com Rituximab
C) ESPLENECTOMIA DIAGNÓSTICA E TERAPEUTICA
Na investigação inicial das neoplasias linfoides leucemizadas por imunofenotipoagem por citometria de fluxo, iniciamos a avaliação com a pesquisa de marcadores pan-B (CD19, CD20 e CD79a), considerando que 80% dos linfomas sistêmicos são derivados de células B.
Confirmada a linhagem B, pesquisamos CLONALIDADE pela restrição de expressão de cadeia leve kappa ou lambda.
O próximo passo é pesquisar marcadores que auxiliam no diagnóstico diferencial, com destaque para o CD5 (típico da LLC e do linfoma de células do manto) e para o CD10 (típico do linfoma folicular, linfoma de Burkitt e linfoma difuso de grandes células B, subtipo centro germinativo).
Quando esses dois marcadores são negativos, devemos considerar três entidades principais:
- Linfoma linfoplasmacítico, incluindo a macroglobulinemia de Waldenström;
- Tricoleucemia; e
- Linfoma da zona marginal, que pode ser do tipo esplênico, nodal ou extranodal conforme a apresentação clínica.
No caso específico do linfoma linfoplasmacítico, além da identificação frequente de componente monoclonal sérico, deve haver expressão de marcadores plasmocitários em pelo menos 10% das células.
No caso da tricoleucemia, identificamos pelo menos três dos seguintes marcadores clássicos: CD11c, CD25, CD103 e CD123.
No linfoma da zona marginal esplênico, a esplenectomia tem finalidade diagnóstica e terapêutica.
O uso de Rituximab em monoterapia seria indicado para pacientes não elegíveis ao procedimento cirúrgico ou refratários à retirada do baço.
Key Points:
- O linfoma da zona marginal pertence ao grupo das neoplasias linfoides CD5 negativas e CD10 negativas e não possui nenhum marcador específico;
- Pode expressar até 2 dos marcadores classicamente relacionados à tricoleucemia, com destaque para a expressão de CD11c.
Referências:
- The WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. 4th revised edition. 2016.
O anticorpo anti-FMC7 tem sua principal utilidade no diagnóstico diferencial entre leucemia linfoide crônica e outras neoplasias linfoides. No gráfico SSC versus FMC7, podemos identificar os linfócitos B normais como a população azul à direita (mostrado abaixo). Nesses casos, qual molécula de superfície é o ALVO do anticorpo anti-FMC7?
A) CD79b
B) CD19
C) CD20
D) CD22
C) ANTI CD20
O anticorpo anti-FMC7 foi descrito em 1981 e sua especificidade permaneceu incerta durante muitos anos.
Seu nome deriva do local onde foi descoberto “Flinders Medical Centre”, localizado na Austrália.
Atualmente, sabemos que o FMC7 é um epítopo glicosilado da molécula CD20.
Nos linfócitos B normais e na maioria das neoplasias linfoides, a intensidade e o padrão de expressão do FMC7 se correlaciona muito bem com o CD20.
Na leucemia linfoide crônica, entretanto, ocorre mudança da conformação terciária da molécula CD20 por mudança no seu padrão de glicosilação, o que impede o reconhecimento do epítopo FMC7.
Dessa maneira, o uso do anticorpo anti-FMC7 tem principal utilidade no diagnóstico diferencial entre LLC (onde será NEGATIVO ou fraco) e as demais neoplasias linfoides.
Key Points:
- O FMC7 é um epítopo glicosilado da molécula CD20;
- Na leucemia linfoide crônica, o FMC7 deixa de ser identificado por alteração na glicosilação da molécula CD20.
Referências:
- Deans JP. FMC7 is an epitope of CD20. Blood. 2008.
Homem, 50 anos, encaminhado para investigação de monocitose persistente há 6 meses, atualmente com 1.500 monócitos/mm³, representando 20% do total de glóbulos brancos. Estudo de imunofenotipagem por citometria de fluxo de sangue periférico mostrado abaixo. Neste caso, qual a principal hipótese diagnóstica?
A) Leucemia mielomonocítica aguda
B) Leucemia mielomonocítica crônica
C) Leucemia monocítica aguda
D) Monocitose reacional
B) LMMC
Uma abordagem diagnóstica bastante útil na investigação de monocitose persistente por mais de TRÊS meses é a IMUNOFENOTIPAGEM por citometria de fluxo de sangue periférico.
A análise do padrão de expressão dos marcadores monocitários CD14 e CD16 é capaz de identificar pacientes portadores de leucemia mielomonocítica crônica (LMMC) com sensibilidade >90% e especificidade >95%.
Existem três populações monocitárias de interesse, conforme o padrão de expressão desses marcadores:
- MO1 (clássica): CD14 positivo forte e CD16 negativo;
- MO2 (intermediária): CD14 positivo forte e CD16 positivo;
- MO3 (não-clássica): CD14 positivo fraco e CD16 positivo;
Na LMMC, a população MO1 está aumentada (representando >94%) e a população MO3, reduzida.
Esse dado é útil na diferenciação entre monocitose reacional e LMMC.
Key Points:
- O diagnóstico diferencial entre leucemia mielomonocítica crônica e monocitose reacional pode ser feita por meio do padrão de expressão dos marcadores CD14 e CD16;
- Na LMMC, >94% dos monócitos são CD14 positivo forte e CD16 negativo.
Referências:
- Valent P. Oligo-monocytic CMML and other pre-CMML states: Clinical impact, prognostication and management. Best Practice & Research Clinical Haematology. 2020.
Menina, 8 anos, diagnosticada com leucemia aguda. Estudo de imunofenotipagem de medula óssea por citometria de fluxo mostrado abaixo. Neste caso, qual o diagnóstico mais provável?
A) Leucemia linfoblástica aguda B comum
B) Leucemia mieloide aguda com t(8;21)
C) Leucemia de fenótipo misto
D) Leucemia bifenotípica
C) LEUCEMIA COM FENÓTIPO MISTO
Na gate inicial, observamos uma população de células anormais localizada na janela de blastos, com CD45 de fraca expressão (CD45dim) e SSC de baixa intensidade.
Na busca por marcadores definidores de linhagem, observamos os seguintes achados:
- Marcadores mieloides: MPO positiva, confirmando linhagem mieloide;
- Marcadores linfoides B: CD19 positivo forte associado a CD10 positivo, CD79a positivo e cCD22 positivo, confirmando linhagem linfoide B;
- Marcadores linfoides T: presença de CD5 e CD7 anômalos, porém SEM critérios para definição de linhagem T, visto a ausência de CD3.
Além disso, observamos a presença de CD34, que é um marcador de imaturidade compatível com o diagnóstico de leucemia aguda.
Portanto, como uma ÚNICA população de blastos apresenta imunofenótipo definidor de duas linhagens CONCOMITANTES, temos o diagnóstico de leucemia de fenótipo misto B/mieloide.
No caso de uma leucemia bifenotípica, também existiriam marcadores de duas linhagens, porém identificados em duas populações de blastos DIFERENTES.
Key Points:
- A leucemia de fenótipo misto é uma leucemia aguda rara, apresenta mau prognóstico e se caracteriza pela presença de marcadores definidores de pelo menos duas linhagens simultaneamente em uma mesma população de blastos;
- O fenótipo mais comum de leucemia de linhagem mista é B/mieloide.
Referências:
- The WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. 4th revised edition. 2016
Referências da imagem:
- Renu Sukumaran R, et al. Flow cytometric analysis of Mixed phenotype acute leukemia: Experience from a tertiary oncology center. Indian Journal of Pathology and Microbiology. 2015.
Homem, 52 anos, encaminhado para avaliação de recaída de TRICOLEUCEMIA. Imunofenotipagem de sangue periférico por citometria de fluxo mostrada abaixo. Neste caso, qual cor representa a população de células neoplásicas?
A) Azul claro
B) Preta
C) Azul escuro
D) Rosa
D) ROSA
A tricoleucemia é uma neoplasia linfoide B madura que apresenta distribuição de idade bimodal, com um primeiro pico por volta dos 40 anos.
Apresenta alta frequência de mutações no gene da cadeia pesada da imunoglobulina (IGHV) e tipicamente possui a mutação V600E do gene BRAF.
Seu imunofenótipo é bastante característico, com alta expressão dos marcadores linfoides B CD19, CD20 e CD22, cuja intensidade é MAIOR em relação aos linfócitos B normais e as demais neoplasias linfoides.
Também expressa as integrinas CD11c e CD103 e os receptores das citocinas inflamatórias interleucina 2 (CD25) e interleucina 3 (CD123).
Variações fenotípicas podem ocorrer, com destaque para a expressão aberrante de CD5, CD23 e/ou CD10.
Eventualmente, pode haver perda de CD103 e CD25 na população neoplásica.
Outro marcador útil é o CD305, cuja expressão também é MAIS intensa em relação aos linfócitos B normais.
Key Points:
- A tricoleucemia é a neoplasia linfoide com expressão mais intensa de CD19, CD20 e CD22.
Referências:
- Garnache Ottou F, Chandesris MO, Lhermitte L, Callens C, Beldjord K, Garrido M, Bedin AS, Brouzes C, Villemant S, Rubio MT, Belanger C, Suarez F, Deau B, Lefrère F, Hermine O, Asnafi V, Varet B, Macintyre E. Peripheral blood 8 colour flow cytometry monitoring of hairy cell leukaemia allows detection of high-risk patients. Br J Haematol. 2014 Jul;166(1):50-9. doi: 10.1111/bjh.12839. Epub 2014 Mar 25. PMID: 24661013.
Homem, 40 anos, encaminhado para avaliação devido pancitopenia. Mielograma identificou 60% de blastos, representados pela cor verde no estudo de citometria de fluxo (mostrado abaixo). Neste caso, qual o imunofenótipo mais provável?
(A) CD11c positivo, CD14 positivo e CD64 positivo
(B) CD117 positivo, CD34 negativo e HLA-DR negativo
(C) CD117 positivo, CD34 positivo e HLA-DR positivo
(D) CD19 positivo, TdT positivo e CD10 positivo
(B) CD117 positivo, CD34 negativo e HLA-DR negativo
A gate inicial CD45 x SSC mostra que a população em verde tem uma expressão INTERMEDIÁRIA de CD45, característica de células blásticas.
Entretanto, essa população NÃO se localiza na “janela de blastos” convencional.
Isso ocorre devido ao ALTO valor de SSC, correspondente à alta granularidade das células leucêmicas.
*Dentre as leucemia agudas, aquela com maior conteúdo GRANULAR é a leucemia promielocítica aguda *(forma hipergranular ou clássica), onde a gate CD45 x SSC identifica esse aspecto característico.
Tratando-se de provável LPA, temos como fenótipo típico:
- CD117 positivo;
- CD34 negativo
- HLA-DR negativo
Outros marcadores mieloides característicos são CD13 positivo com padrão HETEROGÊNO e CD33 positivo com padrão HOMOGÊNEO.
Key Points:
1. Os blastos da leucemia promielocítica aguda, forma hipergranular, apresentam CD45 de expressão intermediária (CD45dim) e localizam-se fora da “janela de blastos” devido à alta granularidade do citoplasma.
Referências:
- The WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. 4th revised edition. 2016.
