HC 20 Microscopie en HC 21 Flowcytometrie

Question 1

Lichtmicroscopie

Answer 1

• Dit kan om cellen te bekijken
• Gebruik van licht: cellen gaan een interactie aan met het licht
• Gebruik van Köhler om het beeld scherp te zetten in het licht (perfecte brandpunt)
• Het licht moet door iets geabsorbeerd worden om de cel te kunnen zien of om in de cel te kunnen kijken → kleuring nodig

Question 2

Donker veld microscoop

Answer 2

• Nuttig voor visualisatie van kleine organismen en deeltjes die niet zichtbaar zijn onder gewone lichtmicroscopen
• Geschikt voor bestuderen van levende organismen en detecteren van bewegende structuren
• Verlichting via donker veld condensor zorgt voor verstrooiing van het licht door het monster
• Objecten verschijnen helder tegen een donkere achtergrond
• Nuttig voor bestuderen van micro-organismen die moeilijk te kleuren of kweken zijn
• Kan worden gebruikt om concentratie van deeltjes in vloeistoffen te meten

Question 3

Fase-contrast microscoop

Answer 3

• Type lichtmicroscoop
• Vergroot contrast van ondoorzichtige monsters
• Gebruikt een ander soort lichtbundel dan conventionele microscopen
• Lichtgolven worden vertraagd en uit fase gebracht
• Faseverschillen worden omgezet in amplitudeverschillen
• Vergroot zichtbaarheid van details in het monster
• Nuttig voor visualisatie van ondoorzichtige, transparante monsters
• Nuttig voor bestuderen van structuur en functie van cellen en weefsels

Question 4

Fluorescentie microscoop

Answer 4

• De lichtbron kleur kan geselecteerd worden
• Licht gaat via de spiegel naar een object → vertoning van emissie en absorptie blauw licht
• Band pass filter → vaak komt er een mengsel van kleuren terug. Om 1 kleur te kunne bekijken zal je deze er dus uit moeten filteren
• Dichroic filter/mirror: spiegelt blauw licht maar laat het groene licht door
• Daarmee kunnen verschillende kleuringen in een microscopisch plaatje gezet worden

Question 5

Confocale microscoop

Answer 5

• Maakt gebruik van een laser om het monster te scannen en de fluorescerende delen te detecteren
• Een pinhole-diaphragma wordt gebruikt om het licht alleen van een bepaald focuspunt te verzamelen, waardoor het beeld scherper wordt
• Kan worden gebruikt voor 3D-beeldvorming van monsters met hoge resolutie
• Kan worden gebruikt voor het maken van levend beeld van cellen en weefsels

Question 6

Immunohistochemische

Answer 6

• Een techniek die antilichamen gebruikt om specifieke eiwitten in weefsels te detecteren en lokaliseren
• Kan worden gebruikt om de aanwezigheid en locatie van specifieke eiwitten of antigenen in weefsels te bepalen

Question 7

Voordelen fluorescentiemicroscopie in vergelijk met lichtmicroscopie

Answer 7

• Donkere achtergrond waardoor het beeld duidelijker wordt
• Hoge sensitiviteit
• Polychromatisch: meerdere kleuren tegelijk gebruiken
• Difractie barrière is overschreden

Question 8

Immersie olie

Answer 8

• Immersie olie heeft dezelfde refractie index als glas
• Daardoor wordt licht niet gerefracteerd waardoor we rechtdoor kunnen kijken
• Geen immersie olie → moet het het licht door lucht en dat wordt het wel gerefracteerd

Question 9

Werking flowcytometrie

Answer 9

1. Fluidics: de cellen worden een voor een door een volume geperst
   a. Hydrodynamische focus: een vloeistof met een hogere snelheid langs de celsuspensie laten lopen waardoor de cellen achter elkaar komen te liggen
   b. Beam shaping: Laser kleur wordt plat en breed
2. Optische gedeelte: er wordt fluorescent licht door de vloeistof heen gestraald
   a. Interactie tussen licht en object
   i. Refractie: buiging van licht (voorwaarts en zijlings)
   ii. Diffusie: reflectie verstrooiing van licht waardoor het afbuigt
   b. Daarnaast door fluorescentie cellulaire analyse
3. Electronics: hierna moeten de detectoren het licht opvangen
   a. Het meeste fluorescente licht gaat verloren
   b. De fotonen die op de kathode vallen veroorzaken een elektronen puls
   i. Hiervan kan hoogte, breedte en integraal van worden afgeleid
   c. De waardes zijn allemaal relatief en zullen dus logaritmisch of lineair worden gepresenteerd

Question 10

Spectraal overlap

Answer 10

• Spectrumoverlap verwijst naar het fenomeen waarbij de fluorescentiesignalen van verschillende kleurstoffen elkaar kunnen beïnvloeden.
• Dit kan leiden tot verkeerde interpretaties van de gegevens.
• Kleurencompensatie wordt gebruikt om deze overlap te corrigeren.

Question 11

Cel sortering

Answer 11

• techniek om individuele cellen te scheiden op basis van hun fysische of chemische eigenschappen.
• Dit wordt gedaan door de cellen één voor één door een flowcytometer te laten stromen en de gewenste cellen te selecteren en te scheiden van de rest van de cellen.

Question 12

kwantitatieve flowcytometrie

Answer 12

• Kwantitatieve flowcytometrie is het proces waarbij de hoeveelheid van een bepaald molecuul of eiwit in individuele cellen wordt gemeten.
• Dit wordt gedaan door de cellen te labelen met fluorescerende kleurstoffen die specifiek zijn voor het molecuul of eiwit van interesse en deze vervolgens te analyseren met een flowcytometer.
• De hoeveelheid van het molecuul of eiwit in elke cel kan worden bepaald door de signalen van individuele cellen te meten en te analyseren.

Question 13

Kleurcompensatie

Answer 13

• het proces waarbij de overlap tussen de fluorescentiesignalen van verschillende kleurstoffen wordt gecorrigeerd.
• Dit wordt gedaan door monsters met één kleurstof te meten en de instellingen van de flowcytometer aan te passen om de overlap te corrigeren.