3.7: Proteomics, metabolomic, miRNAs, RNAi screens

Question 1

Proteomics

Answer 1

Richt zich op het begrijpen van het volledige eiwitprofiel; bestudeert alle eiwitten van een cel. De hoeveelheid eiwit is een betere maat voor genexpressie van mRNA. Nog niet zo snel en gemakkelijk, naar nieuwe en verbeterde technieken maken dit wel mogelijk

Question 2

Trypsine

Answer 2

Knipt peptidebindingen vna eiwitten op specifieke plaatsen (arginine en lysine) -> dus tryptische fragmenten beginnen met een K of R en eindigen als ze een K of R tegenkomen

Question 3

Massa spectrometrie:

Answer 3

Moleculen raken door laser positief geladen, plaat is ook positief geladen dus moleculen komen van plaat af
- Snelheid waarmee ze vliegen is afhankelijk van lading en massa
- In vacuumbuis zodat moleculen niet tegen andere deeltjes aan botsen

Question 4

Actief eiwit:

Answer 4

Als we weten dat een eiwit actief wordt door bv een fosfaatgroep dan kunnen we meten welk deel van dat eiwit de fosfaatgroep heeft en welk deel dus actief zal zijn

Question 5

Eiwit interactie mapping:

Answer 5

Toevoeging lysaat / antilichaam specifiek voor bepaald eiwit aan eiwitmengsel -> antilichaam bindt een bepaald eiwit inclusief al de eiwitten die een interactie vormen -> massaspectrometrie voor gebonden eiwitten

Question 6

Eiwit modificatie identificatie

Answer 6

Afbraak door trypsine -> fosfaatgroep aan peptiden -> massaspectrometrie: eerste piek eiwit zonder fosfaatgroep en tweede piek zelfde eiwit met fosfaatgroep

Question 7

Metabolomics

Answer 7

Analyseert welke metabolieten voorkomen (suikers, nucleotiden, aminozuren)

-> hierdoor mogelijk tumor herkennen: een tumor maakt metabolieten aan die normaal niet in grote hoeveelheden gemaakt worden
-> ook wordt geanalyseerd via massaspectrometrie - Stap van trypsine kan over worden geslagen omdat ze al klein genoeg zijn
-> Sample preparation: evt zuiveringsstap -> massa spectrometrie -> identificatie mbv computer -> herkennen van patroon -> wat is de biomarker

Question 8

mRNA zorgt niet alleen voor eiwitactiviteit, maar ook voor:

Answer 8

• Regulatie van eiwitmodificaties
• Regulatie van eiwitstabiliteit
• Regulatie van translatie -> op niveau van microRNAs

Question 9

Waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?

Answer 9

• Regulatie translatie
• Eiwitstabiliteit (afbraak door proteases)
• Regulatie van eiwitmodificaties (fosforylering, etc.)

Question 10

microRNA microarrays

Answer 10

Kunnen de expressie van honderden miRs tegelijkertijd bepalen en dit kan net als bij mRNA expressieprofielen geanalyseerd worden

Question 11

Remming mRNA

Answer 11

siRNA’s - zorgen voor mRNA afbraak

• gemaakt door afbraak dicer
• Door een specifieke siRNA in de cel te brengen, kunnen specifieke stukken mRNA afgebroken worden (is in de praktijk echter nog niet mogelijk)

Question 12

Voordelen RNAi

Answer 12

• Kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen
• Heel eenvoudig toe te passen op elk willekeurig gen waar je de sequentie van weet
• Zeer specifiek
• Door het mRNA op verschillende plekken met siRNAs aan te pakken, zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan
• Zeer geschikt voor hoge doorvoer analyses (RNAi libraries)

Question 13

Nadelen RNAi

Answer 13

• Kan in principe alleen gebruikt worden om expressie te remmen
• We weten nog neit hoe we het siRNA in de gewenste cellen moeten inbrengen

Question 14

Remming eiwit

Answer 14

Remming kinase activiteit van bijvoorbeeld BCR-ABL fusiegenen:

Nadelen: specificiteit laag, gemakkelijke resistentie, geschikte remmer vinden moeilijk