2.6: Next Generation Sequencing

Question 1

Sanger Sequencing / PCR

Answer 1

1. Denaturatie: splitsing dsDNA tot ssDNA 90-95 oC
2. Hybridisatie: binding primers aan ssDNA 50-60 oC
3. Elongatie: aanvulling DNA door Raq-polymerase vanaf primers met losse nucleotiden/dNTP’s (dATPS, dCTPs, dGTPs en dTTPs) die gefluoresceerd zijn waardoor je de nucleotiden kan lezen

Question 2

Methode voor NGS:

Answer 2

• Amplicon Enrichment
• Hybridization Enrichment

Question 3

Amplicon Enrichment

Answer 3

Belangrijk deel van het genoom wrodt gePCRt -> adapters worden er aan gehangen zodat het te herkennen is welk specifiek stukje DNA is geanalyseerd -> Meer adapters worden er aan gehangen die kunnen binden aan primers en aan flow cell -> binding aan flow cell -> binding aan primers -> PCR -> Sequencing -> Meter gaat nucleotiden langs en plakt barcodes blauw aan T, groen aan G, oranje aan C en paars aan A, en plakt aan gezond of gemuteerd een kleur

Question 4

Variant allel frequency, VAF

Answer 4

Aantal malen dat een mutatie/DNA-variatie op een specifieke positie wordt gevonden ten opzichten van het referentie-DNA

Question 5

Coverage / deep sequencing

Answer 5

Aantal malen dat een base-positie onafhankelijk bepaald is, des te hoger de coverage des te ‘deeper’/beter gesequenced is

Question 6

Hybridization enrichment

Answer 6

Meerdere delen van het genoom worden gepakt en het DNA wordt dus in kleine fragmenten gesplitst -> adapters worden er aan gehangen zodat het te herkennen is welk specifiek stukje DNA is geanalyseerd -> Capture van belangrijk deel van het genoom met een probe -> sequence

Question 7

RefCov vs VarCov

Answer 7

RefCov: hoe vaak wildtype (niet mutatie) gerepliceerd is

VarCov: hoe vaak variant (mutatie) gerepliceerd is