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Compl. de Bio et Élém. Génomique > Thérapie génique l > Flashcards

Thérapie génique l Flashcards

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Biology 101 flashcards
1
Q

Quels sont les 4 objectifs de la thérapie génique?

A

remplacement, inhibition, addition et correction d’un gène

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Q

Quels sont les deux voies de la thérapie génique?

A
  • modification des cellules in vivo
  • modification des cellules ex vivo
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Q

Expliquer les étapes de la modification de cellules in vivo

A

Un gène thérapeutique est introduit à de l’ADN nu par un vecteur viral.
L’ADN modifié contenu dans un lyposome est introduit dans le patient.

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Q

Explique les étapes de la modification de cellules ex vivo

A
  1. Les cellules malades sont prélevés du patient.
  2. Les cellules sont mise en culture
  3. Un retrovirus contenant le gène à transférer infecte les cellules en culture.
  4. Les cellules génétiquement modifiées sont réintroduites dans le patient.
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Q

Quelle est la différence entre les 2 voies de la thérapie génique?

A

In vivo: on introduit dans le un gène thérapeutique sans utilisé les cellules du patient

Ex vivo: on introduit un gène thérapeutique via des cellules prélevées du patient qui seront réintroduitent.

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6
Q

Quelles sont les 2 classes de virus et donner des exemples pour chaque classe.

A
  • Viraux : rétrovirus, adénovirus, AAV
  • Non-viraux : liposome (ADN/ARN), ADN/ARN nu
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7
Q

Qu’est ce qu’un vecteurs viraux?

A

un virus génétiquement modifié et utilisé pour infecter des cellules (transduction) dans le but de qu’elles expriment un transgène.

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8
Q

Les premiers vecteurs viraux ont été développé à partir de quel virus?

A

SV40

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9
Q

Quelles sont les vecteurs viraux les plus important en thérapie génique?

A
  • rétrovirus et lentivirus
  • adénovirus
  • virus adéno-associés
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10
Q

Qu’est-ce qu’un vecteur intégratif?

A

Il insère leur ADN qui contient le gène thérapeutique dans le génome de l’hôte via des cellules qui peuvent effectuer de la division cellulaire.

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11
Q

Qu’est-ce qu’un vecteur non intégratif?

A

Il s’agit de faire pénétrer un transgène contenant le gène thérapeutique dans les cellules de l’hôte qui se divise plus (cellule post-mitotique).

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12
Q

Quelle est la différence entre les vecteurs intégratifs et non intégratifs du point de vue de la transmission génique?

A

-Le vecteur intégratif permet la transmission du gène thérapeutique aux cellules fille lors de divisions cellulaires.
-Le vecteur non intégratif permet au gène thérapeutique de rester seulement dans la cellule de l’hôte sans possibilité de transmission aux cellules filles puisque le gène est pénétrer dans une cellule post-mitotique.

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13
Q

Quelle est la différence entre les vecteurs intégratifs et non intégratifs du point de vue de la durée de la possession du gène thérapeutique?

A

Le vecteur intégratif permet de garder l’expression du gène thérapeutique puisque celui-ci est transmis aux cellules filles.
Le vecteur non intégratif ne permet pas de garder l’expression du gène thérapeutique puisque celui-ci n’est pas intégrer dans le génome et disparait avec la mort de la cellule.

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14
Q

Nommez les 9 caractéristiques recherchées des vecteurs viraux

A
  1. non-pathogénicité
  2. non-multiplication in vivo
  3. capacité d’accueil suffisante (taille du transgène)
  4. non- immunogénicité
  5. expression permanente ou régulée
  6. spécificité tissulaire
  7. infection de cellules mitotiques ou quiescentes
  8. capacité à intégrer le génome à 1 seul site spécifique
  9. pas d’infection des lignées germinales
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15
Q

Comment se nomme les lignées cellulaires immortalisées servant à la production de vecteurs viraux?

A

lignée d’encapsidation (HEK293)

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16
Q

Quelles sont les deux caractéristiques physiologiques des lignées d’encapsidation tel que HEK293?

A

Elle est immortelle:
- elle prolifère de manière illimitée
- les cellules échappent au phénomène d’apoptose
(elle inhibe Rb et p53)

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17
Q

Pourquoi les lignées d’encapsidation sont-elles devenues immortelles?

A

Grâce au gène Large-T antigène du simian Virus 40 (SV40)

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18
Q

Quel est le type d’ADN pour la transfection de cellules eucaryote?
Quel est le moyen utilisé?

A
  • L’ADN plasmidique.
  • des vecteurs encodant des produit viraux.
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19
Q

Nommez 4 techniques de transfection de cellule eucaryote

A
  • DEAE-Dextran
  • Phosphate de calcium
  • Lipofection
  • Électroporation
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20
Q

Expliquer les étapes de transcription des gènes viraux comme le large-T antigène (LTA)

A
  1. Une cellule est transformée par le SV40 et exprime la protéine LTA.
  2. On transfecte dans la cellule un plasmide d’expression eucaryote qui possède SV40 Ori.
  3. La proteine LTA se lie à l’Ori, ce qui permet la duplication du génome du plasmide SV40.
  4. Augmentation du niveau de transcription pour une proteine.
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21
Q

Comment peut-on contrôler l’expression d’un plasmide?

A

en utilisant des promoteurs inductibles qui peuvent être régulés par un contrôle positif ou négatif.

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22
Q

nommez un exemple d’agent inducteur et son rôle

A

la tétracycline (tet)
- permet l’activation ou non du promoteur.

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23
Q

Quels sont les 2 systèmes d’expression inductibles?

A

tet-off
tet-on

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24
Q

Expliquer le système d’expression inductible tet-off

A

En l’absence de tétracycline: le transactivateur tTA se lie aux élément de réponse à la tétracycline (TRE), favorisant l’expression du gène.
En présence de tétracycline: L’activateur rtTA (transactivateur inverse) est normalement inactif et ne peut pas lier les éléments de réponse à la tétracycline (TRE) dans un promoteur.

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25
Q

Pourquoi l’adénovirus est hautement immunogène?

A

Nous sommes exposé à des adénovirus dans notre environnement donc nous développons une immunité contre ces adénovirus. Certain vecteur d’adénovirus exprime des protéines qui sont identiques/très semblable a celle rentrer dans l’environnement de sorte que lorsque que on administre les vecteurs, on réactive des réactions immunitaires contre cette protéine du virus comme si elle appartenait à un adénovirus environnant.

26
Q

Qu’est ce qu’est les plasmides multicistroniques?

A

Plasmide qui contient un rapporteur (gène de fluorescence ou de résistance) garantissant que toutes les cellules positives pour le marqueur expriment le gène d’intérêt puisque ils sont dérivés du même transcrit (même promoteur).

27
Q

Qu’est-ce qu’est le IRES (internal ribosome entry site)?

A

Séquence d’ADN permettant d’exprimé 2 gènes à partir du même transcrit/promoteur.

28
Q

Qu’est-ce qui permet le saut de ribosome permettant la transduction de 2 gènes?

A

«self-cleaving» 2A peptides

29
Q

Quels sont les 2 types de rétrovirus et leurs caractéristiques

A
  • Gamma-rétrovirus: intègre les cellules seulement en division.
  • Lentivirus: intègre les cellules quiescentes.
30
Q

Quelles sont les étapes d’intégration de vecteurs de type gamma-rétrovirus?

A
  1. ARN simple-brin adopte structure en boucle et tige.
  2. Le génome du virus subit une transcription réverse et produit des LTR agissant comme promoteur qui permet l’intégration aléatoirement dans le génome de l’hôte.
  3. Les intégrations aléatoires provoquent des mutations insertionnelles.
  4. Les séquences virales intégrées sont répliquées au cours de la division cellulaire
31
Q

Que permet les LTR?

A
  • L’intégration génomique en agissant comme promoteur
  • Le LTR en 5’ permet la transcription
  • Le LTR en 3’ fournit la séquence AATAA (coupure de la queue poly-A)
32
Q

Qu’est-ce que le signal Psi?

A

donne le signal d’encapsulation et indique que l’ARN transcrit va aller à la surface de la cellule.

33
Q

Quels sont les 3 plasmides nécessaires pour produire des gamma-rétrovirus

A
  • plasmide contenant le transgène
  • plasmide contenant gag et pol
  • plasmide contenant env
34
Q

Comment produire un retrovirus recombinant

A
  1. La lignée d’encapsidation HEK 293 exprime la proteine E1 afin d’induire le promoteur CMV présent dans tout les plasmide utilisé.
  2. On co-transfecte aux HEK293 trois plasmides.
  3. les cellules transfectées vont donc exprimées Gap, pol env qui permettent l’encapsidation de la séquence d’intérêt présente sur un vecteur contenant les LTR.
35
Q

Pourquoi le gag pol env ne sont pas encapsulé?

A

Afin que les virions générés n’auront pas la capacité de se répliquer dans l’hote (défectifs)

36
Q

Quelle est la particularité de la protéine Enveloppe VSV-G?

A

elle dicte le tropisme: l’entrée dans virus dans des types cellulaires précis.
- Modifiant la séquence Env, on peut modifier les virions de telle sorte qu’ils puissent entrer dans certains types cellulaires préférentiellement.

37
Q

De quoi est composé le génome du VIH?

A
  • 3 gènes de structure (gag, pol, env)
  • 2 gènes de régulation (rev, tat)
  • 4 gènes accessoires (vif, vpr, vpu, nef)
38
Q

Sur quel génome est basé les vecteurs des lentivirus?

A

le génome du VIH

39
Q

Quelles sont les 2 méthodes pour produire un vecteur AAV?

A
  • l’approche de tri-transfection
  • à partir du système d’expression baculovirus (BEVS)
40
Q

Quelle caractéristique que confère la proteine enveloppe VSV-G au virus?

A

Elle confère une structure solide au virus donc plus résistante à la centrifugénèse

41
Q

Qu’est-ce qui permet d’augmenter l’efficacité de la transduction des rétrovecteurs?

A
  • L’utilisation des polybrene réduit la charge de répulsion entre les virions et les cellules ciblent.
  • La retronectin augmente l’efficacité de transduction de certains lenti-vecteurs en augmentant l’adhésion.
  • La spinoculation (centrifugation en présence de retrovecteurs) induit un stress cellulaire qui augmente l’endocytose des virions.
42
Q

Quelle est la différence entre les vecteurs AAV et les vecteurs retrovirus?

A

AAV: transmet de l’ADN
Retrovirus: transmet de l’ARN

43
Q

Pourquoi dit-on que les AAV sont dépendovirus?

A

ils dépendent de la présence d’un autre virus pour se multiplié

44
Q

Décris la structure du génome d’un AAV

A
  • séquence ITR
  • REP: 4 proteines impliquées dans la réplication, transcription, l’intégration et l’assemblage des virions
  • Cap: 3 proteines structurantes qui forment la capside
45
Q

Quel est le rôle de REP et Cap?

A

Ils agissent comme promoteur et produisent AAV

46
Q

Comment on produit des vecteurs AAV?

A
  1. trois plasmide sont nécessaires et qui seront transfectés dans la cellule
    a) vecteur AAV exprimant le transgène entre les ITR
    b) ADN d’adénovirus exprimant les gènes E2, E4 et VA
    c) AAV helper exprimant les gènes REP et Cap
47
Q

Quels sont les limitations des vecteurs AAV et les solutions

A

A) Les anticorps préexistants contre les AAV sont répandus dans 20% à 40% de la population adulte et peuvent neutraliser le vecteur et réduire ainsi l’efficacité ;
-Solution: exclure ces patients (pas idéal)
B) Une réponse immunitaire cellulaire retardée à la capside de l’AAV, survenant 4 à 12 semaines après la perfusion du vecteur, peut entraîner la destruction des cellules transduites et une perte d’efficacité thérapeutique
-Solution: administration d’immunosuppresseurs (corticostéroides) car les peptides dérivés de la capside sont présents que de manière transitoire

48
Q

Qu’est ce qu’est la production AAV à partir de baculovirus (BEVS)

A

2 plasmides ( Bac-rep+cap et Bac-transgène) vont intégrer la cellule et le génome d’insecte pour produire un transgène AAV.

49
Q

Décris la structure du génome de l’adénovirus

A

À chaque extrémité du génome se trouvent des répétitions terminales inversées (ITR). Les gènes sont divisés en transcriptions précoces (E1-4) et tardives (L1-5). Il existe 57 types d’adénovirus humains et la plupart des vecteurs adénoviraux sont basés sur Ad5.

50
Q

Comment les vecteurs basés sur Ad5 pénètre dans la cellule?

A

ils utilisent le recepteur Coxsackie-Adenovirus (CAR) pour pénétrer dans les cellules.

51
Q

Quelles sont les 2 mécanismes de production de adénovecteur?

A
  • le système AdEasy
  • adénovecteur gutless
52
Q

Quels sont les étapes de création d’adénovecteur selon le système AdEasy?

A
  1. Le système se compose de deux plasmides: vecteur adénoviral et vecteur navette (ou transfert).
  2. Le transgène d’intérêt est cloné dans le vecteur navette, et linéarisé avec l’enzyme de restriction PmeI. Cette construction est ensuite transformée en cellules AdEasy-1, qui sont des cellules E. coli. contenant un plasmide adénoviral contenant les gènes adénoviraux nécessaires à la production du virus.
  3. Le vecteur navette et le plasmide adénoviral ont des bras d’homologie gauche et droit correspondants qui facilitent la recombinaison homologue du transgène dans le plasmide adénoviral.
53
Q

Quelles sont les types de stratégies d’intégration de vecteurs non viraux

A
  • injection direct d’ADN nu : modifié et protégé des nucléases grâce à des modifications chimiques, ou intégré dans un plasmide.
  • lipofection: : le gène thérapeutique est associé à des lipides cationiques qui favorisent son entrée dans la cellule hôte.
  • l’électroporation/nucléofection : par application d’un champ électrique.
54
Q

Expliquer le principe des oligonucléotides antisens (ASO)

A
  1. le brin 5’-3’ de l’ADN génomique est transcrit.
  2. pré-ARNm produit subit un épissage et la maturation
  3. des AON antisens se lient à l’ARNm
  4. les oligonucléotides antisens empêchent la traduction en detruisant l’ARNm par la RNAase ou en modifiant les sites d’épissage sur le pré-ARNm
55
Q

Quelles sont les 4 limitations des oligonucléotides antisens?

A
  • dégradation par les nucléases plasmatique
  • accumulation dans le foie
  • élimination rapide par les reins
  • faible endocytose cellulaire
56
Q

Qu’est-ce que sont les antisens morpholinos (PMO)?

A

Se sont des molécule synthétiques différentes des acides nucléiques qui ne dégradent pas les molécules d’ARN auxquelles ils se fixent. Ils agissent plutôt par encombrement stérique.

57
Q

Dans quels cas les cellules génétiquement modifiées sont-elles utilisées?

A
  • Maladie hématologique
  • maladie neurodégénérative
  • leucémie/lymphome
58
Q

Quel est le but de la thérapie CAR T?

A

Des cellules T génétiquement modifiées produisent un récepteur antigénique chimérique à leur surface qui les rend aptes à reconnaître et à tuer les cellules cancéreuses.

59
Q

Qu’est-ce qu’un virus oncolytique?

A

Ils sont modifiés génétiquement pour infecter spécifiquement les cellules tumorales qu’ils détruisent.

60
Q

Le premier virus oncolytique a été indiquer pour quel cancer?

A

le mélanome

Compl. de Bio et Élém. Génomique (17 decks)

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