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Compl. de Bio et Élém. Génomique > Technique de biologie moléculaire 1 > Flashcards

Technique de biologie moléculaire 1 Flashcards

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Biology 101 flashcards
1
Q

Quels sont les 4 étapes de l’extraction et quantification des acides nucléiques?

A
  • la lyse des cellules
  • dénaturation des proteines et des complexes nucléoprotéique
  • inactivation des nucléases
  • purification des acides nucléiques
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Q

Quels sont les méthodes de lyse cellulaire?

A
  • chimique (détergent)
  • enzymatique (proteinase K, collagénase et lysozyme)
  • mécanique (bille de broyage)
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Q

Quels sont les agents qui permettent la dénaturation des proteines?

A
  • détergent ionique
  • agent réducteur
  • agent chaotrope (dénature les structures complexe des proteines)
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4
Q

Comment fait-on pour isoler l’ARN?

A

Il faut réaliser une digestion à la DNase I qui permet de dégrader l’ADN génomique présent dans la solution.

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Q

Quelle est l’étape supplémentaire à effectuer pour la lyse tissulaire?

A

Effectuer un pré traitement enzymatique avant de débuter le processus de lyse et de digestion.

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6
Q

Quelle est la conséquence si on n’effectue pas le pré-traitement enzymatique pour la lyse tissulaire?

A

l’ADN isolé sera endommagé (qualité diminuée), présent en très faible concentration (quantité diminuée) et également encore associé aux protéines.

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7
Q

Quel est le rôle de la proteinase K dans la dénaturation et l’inhibition des nucléases

A

Elle hydrolyse les protéines de toutes origines en quelques heures avec une préférence pour les liaisons peptidiques situées après les acides aminés hydrophobes.
- Protéase végétale très active, même en présence de SDS ou d’EDTA, et qui n’a aucun effet d’hydrolyse sur les acides nucléiques

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8
Q

Quel est le rôle du SDS dans la dénaturation et l’inhibition des nucléases

A

C’est un détergent organique capable de dénaturer les protéines en supprimant les liaisons non-covalentes. C’est aussi un tensioactif amphiphile, c’est-à-dire qui présente deux parties de polarité différente, l’une hydrophobique, l’autre hydrophilique. Lors de la dénaturation, les anions du SDS confère aux protéines une charge globale négative.

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9
Q

Quel est le rôle du EDTA dans la dénaturation et l’inhibition des nucléases

A

C’est un agent chélateur puissant qui forme des complexes métalliques très stables. En séquestrant les ions magnésium Mg2+, il bloque l’activité de nombreuses nucléases. L’EDTA est également un inhibiteur des métalloprotéases à zinc et limite ainsi l’hydrolyse des protéines dans les extraits cellulaires.

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10
Q

Quelles sont les précautions à prendre lors de l’isolation des ARN?

A
  1. Inhiber les RNases endogènes en utiliant un solution de lyse contenant un inhibiteur de RNases
    • Agents chaotropes (guanidium isothiocyanate, urée…)
    • Chélateurs (EDTA…)
  2. Solution de lyse: pH non basique car ARNs sensibles aux ions OH-
  3. Eviter l’apport de RNases exogènes:
    • Mains gantées et milieux et matériels autoclavés;
    • Matériel en plastique traité par inhibiteur de RNases
  4. Travailler à 4°C
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11
Q

Dans quelles conditions l’ADN est soluble?

A

soluble dans l’eau à pH alcalin

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12
Q

Dans quelles conditions les protéines sont solubles?

A

soluble dans le phénol à pH acide

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13
Q

Quel est le rôle du chloroforme lors de la purification

A

Beaucoup plus dense que l’eau, donc empêche l’inversion des phases. De plus, il diminue l’interphase – la frontière entre les 2 phases. Mélangé au phénol, il permet aussi d’éliminer ce dernier de la phase aqueuse.

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14
Q

Quels sont les types de purification des acides nucléiques

A
  • purification par phénol/chloroforme
  • précipitaton avec éthanol/sodium
  • purification de l’ADN sur membrane de silice
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15
Q

En quoi consiste la précipitation avec l’éthanol/sodium?

A

L’ajout d’éthanol et de sodium renforce les force d’attraction entre les groupes phosphates de l’ADN et le Na+ ce qui précipite l’ADN.

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16
Q

En quoi consiste la purification de l’ADN sur membrane de silice?

A
  1. Présence de sels chaotropiques
  2. ADN se lié au silice dû à la déshydratation et la formation de ponts hydrogène
  3. Crée un environnement hydrophobe donc la membrane de silice des colonnes est le partenaire de liaison le plus approprié pour les acides nucléiques
  4. Lave les sels à l’alcool et l’ADN est précipité.
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17
Q

Nommez des méthodes utilisées pour quantifier l’ADN.

A
  1. Spectroscopie estime quantitativement le concentration des acide nucléiques
    • les basés azotées de l’ARN et des ADN absorbent l’énergie lumineuse dans la région ultraviolette (max 260 nm)
  2. Par Hoechst 33258
    • méthode basée sur les courbe d’étalonnage à l’aide d’un spectrofluoromètre
  3. PicoGreen
    • méthode basée sur une courbe d’étalonnage à l’aide d’un spectrofluoromètre
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18
Q

Quel est l’effet de la présence de protéines sur l’absorbante des acides nucléiques lors de la qualification de l’ADN?

A

La présence de protéines augmente l’absorbante à 280 nm.

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19
Q

Quel sont les valeurs où devrait se situer le ratio 260/280 de la qualification de l’ADN?

A

Entre 1.8 - 2.0
-la présente de protéine augmente l’absorbance à 280 ce qui diminue le ratio

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20
Q

Une absorbance à 230 et 325 suggère la présence de quel composé?

A

230: présence de phénol ou d’urée
325: présence de particules (poussières)

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21
Q

Quels sont les ratio attendu pour l’ADN pure et l’ARN pure?

A

ADN pure: 1 : 1,8 : 1
ARN pure: 1 : 2 : 1

22
Q

Quelles sont les concentration d’ADN acceptable des différentes méthodes de quantification de l’ADN?

A
  1. L’Absorbance à 260 nm est efficace pour une concentration d’ADN de 1-50 μg/ml
  2. Hoechst 33258 est efficace pour une concentration d’ADN de 0.01 to 15 μg/ml
  3. PicoGreen est efficace pour une concentration d’ADN de 25 pg/ml à 1000 ng/ml
23
Q

Quelles sont les 3 étapes de la technique d’électrophorèse sur gel d’Agarose?

A
  1. Préparation du gel d’agarose selon la taille des fragments à séparer
  2. Application du champ électrique à voltage constant
  3. Visualisation/purification de l’ADN
24
Q

Quels sont les étapes pour préparer le gel d’agarose?

A
  1. Prépare le tampon d’électrophorèse (TAE ou TBE)
  2. Peser et ajouter l’agarose au tampon TAE ou TBE
  3. Bouillir au micro-onde
  4. Couler le gel à une épaisseur de 0,5 - 1 cm dans le support contenant les peignes
  5. Placer le gel dans la chambre d’électrophorèse, ajouter le tampon
  6. Retirer les peignes une fois que le gel à solidifier
  7. Ajouter les échantillons d’ADN
  8. Procéder à l’electrophorèse
25
Q

Quels sont étapes de déposition des échantillons et migration de l’électrophorèse sur agarose?

A
  1. Gel est prêt et recouvert de tampon
  2. Dépote d’un l’échantillon
  3. Dépôt des autres échantillons
  4. Application de la différence de potentiel
  5. Migration des échantillons en fonction de leur taille
  6. Fin de la migration
26
Q

Quel est le rôle des agents intercalants dans l’électrophorèse sur gel d’agarose?

A

Permet de bien visionner les acides nucléiques.

27
Q

Quels sont les information importantes sur le:
- sens du courant
- voltage
- taille des molécules
- % d’agarose de l’électrophorèse sur gel d’agarose?

A
  • sens du courant: acides nucléiques étant chargés négativement, migrent vers la borne positive
  • voltage: plus la différence de potentiel s’entre les 2 bornes est grande, plus la migration sera rapide (cependant un voltage élevé peut augmenter le température du gel et mener à sa fusion
  • taille des molécules: à cause de la structure poreuse de l’agarose, ca retarde la migration des acides nucléiques. Les molécules sont grosses plus elles sont retardées
  • % agarose: gel concentré en agarose augmentera la séparation entre les grosses et petites molécules
28
Q

Quelles sont les étapes de la transfection par agents cationiques lipidiques des cellules eukaryotes?

A
  1. Mélange l’ADN avec un agent cationique lipidique (sans sérum)
  2. Formation de complexes (incuber 15 min à température ambiante)
  3. Ajouter le milieu de transfection
  4. Rinser les cellules avec le milieu de transfection
  5. Incuber 2-24h et changer le milieu (expression du plasmide entre 24-48h)
29
Q

Quels sont les types de Transfection?

A
  1. Transfection par agents cationiqueslipidiques
  2. Transfection par calcium phosphate
  3. Transfection par électroporation
30
Q

Quelle est la méthode de transfection par calcium phosphate?

A
  • Basé sur la formation d’un précipité lorsqu’on mélange lentement une solution phosphate temporisée et une solution de chlorure de calcium (CaCl2) contenant l’ADN.
  • Le précipité adhère ensuite aux cellules et pénètre par endocytose. Selon le type cellulaire, jusqu’à 10% des cellules peuvent être ainsi transfectées.
31
Q

Quelle est la méthode de transfection par électroporation?

A

Basée sur le fait que des pulsations électriques (millisecondes) générent des trous dans la membrane cellulaire, permetant ainsi à l’ADN de pénétrer la cellule

32
Q

Quel est le processus d’hybridation des acides nucléiques?

A

Appariement, par complémentarité des bases, de deux séquences nucléotidiques, en antiparallèle.
- ADN/ADN ou ADN/ARN ou ARN/ARN
- Une des deux séquences sert de sonde pour détecter la cible

33
Q

Qu’est-ce qu’une sonde dans la méthode d’hybridation des acides nucléiques?

A
  • Au moins 15 nucléotides
  • Complémentaire d’une séquence ADN ou ARN cible
  • Hybridation stable et spécifique
  • Sonde doit être marqué donc il doit porter un élément distinctif (marqueur)
34
Q

Qu’est-ce qu’on détecte lors de l’hybridation des acides nucléiques?

A

On détecte que la sonde radioactive donc indirectement la cible.

35
Q

Que peut être le marqueur pour l’hybridation des acides nucléiques?

A
  • Isotope radioactif: sonde radioactif
  • Non radioactif: sonde froide (ex: fluorescence)
36
Q

Qu’est-ce qu’un marquage radioactif de l’hybridation des acides nucléiques?

A
  • Isotope radioactif d’un atome qui est le plus souvent le 32P
  • Émet un rayonnement/impression sur un film photographique qui permet le repérage des hybrides par autoradiographie (détection de la radioactivité)
37
Q

Comment on utilise un marquage froid de l’hybridation des acides nucléiques?

A

Utilise marqueur froid dont la biotine ou le DIG
1. Synthèse de la sonde ayant incorporé la marqueur
2. Hybridation spécifique entre la sonde marquée et la cible
3. Détection grâce à l’avidine qui s’accrochera sur la biotine, ou anticorps anti-DIG couplé à une enzyme HRP ou PA (phosphate alcaline) + substrat

38
Q

Quels sont les techniques d’hybridation des acides nucléiques?

A
  1. Blotting
  2. Dénaturation/renaturation
  3. Southern Blot
39
Q

Qu’est-ce que la technique de Blotting de l’hybridation des acides nucléiques?

A
  • Technique permettant l’étude de fragment cibles (ADN ou ARN) par hybridation d’une sonde nucléique (ADN ou ARN)
  • Technique reposant sur la notion de spécificité d’appariements des bases
  • Nécessite de dénaturer les acides nucléiques afin d‘obtenir un ADN simple brin et/ou éliminer les structures secondaires des ARN
40
Q

Qu’est-ce que la technique de dénaturation/renaturation de l’hybridation des acides nucléiques?

A
  • Phénomène réversible pour accéder à l’information génétique lors de la réplication et de la transcription;
  • Nécessite la rupture des liaisons hydrogènes entre les bases
  • En recherche, la dénaturation/renaturation est essentielle pour l’étude des acides nucléiques in vitro et in vivo (par PCR, Hybridation moléculaire…)
41
Q

Qu’est-ce que la technique du Southern Blot de l’hybridation des acides nucléiques?

A
  1. L’ADN est digéré par les enzymes de restriction
  2. Séparation des fragments digérés par électrophorèse sur gel d’agarose
  3. Le gel d’électrophorèse est trempé dans une solution alcaline (contenant habituellement de l’hydroxyde de sodium) afin de permettre la dénaturation de l’ADN (séparation de l’ADN double-brin en simple-brin).
  4. Une feuille de membrane en nitrocellulose ou en nylon est placée sur le gel. Une pression est appliquée au gel par un poids.
  5. Déplacement de l’ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité grâce à une solution saline et à l’utilisation de papier absorbant. L’ADN va se fixer sur la membrane.
  6. La membrane est ensuite chauffée (dans le cas de nitrocellulose) ou exposée au rayonnement ultraviolet (nylon) afin de fixer de manière permanente l’ADN sur la membrane.
  7. La membrane est ensuite mise en contact avec une sonde spécifique de la séquence d’ADN recherchée. La sonde est marquée de sorte qu’elle puisse être détectée, par incorporation de radioisotopes ou par “étiquetage” de la molécule avec un fluorophore ou un antigène tel que la digoxygénine (DIG).
  8. Après hybridation, la sonde en excès est éliminée de la membrane par différents lavages, et l’hybridation est visualisée sur un film autoradiographique, dans le cas d’une sonde radioactive ou fluorescente.
42
Q

Quelles sont les étape de la technique FISH (Fluorescent In Situ Hybridation)?

A
  1. DNAase fait une coupure dans l’ADN
  2. Ajout d’une molécule soit Dig, biotine ou dCTP + dATP + dGTP sur le bris de l’ADN
  3. Dénaturation
  4. Hybridation
  5. Anticorps lié à un fluorophore se lie à la molécule
  6. Observe sous microscopie à épifluorescence
43
Q

Qu’est-ce que la technique d’extraction mécanique d’isolation des protéines?

A
  1. Un sonificateur génère des ondes de pression ultrasoniques qui causent des croissance de microbulles par «cavitation»
  2. Bulles sont soumises à un grand stress par les ondes ultrasoniques et peuvent subitement grandir, se contracter et imploser
  3. Haute augmentation locale de la pression et de la température (microbulle qui implose peut faire grimper la température à 5 000 degré et sa pression atteindre plusieurs centaines d’atmosphère)
    -garder sur glace
44
Q

Quels sont les composés nécessaires pour faire l’extraction par la lyse lors du processus d’isolation des protéines?

A
  • Composition de base
  • Inhibiteurs de protéases
  • Agent chelateur
  • Inhibiteurs de phosphatases
45
Q

Comment on purifie des protéines lors du processus d’isolation des protéines?

A
  1. Par filtration
    -choisi la bonne taille du filtre en fonction de la taille moléculaire de la protéine à isoler
  2. Purification par chromatographie sur colonne
    -séparation des protéines selon leur taille utilisant un tamis moléculaire
    -colonne de chromatographie pour filtration sur gel remplie d’une résine consistant en billes creuses et poreuses
46
Q

Quels sont les types de quantification des protéines?

A
  1. Par spectrophotométrie
    -détermine l’absorbance à 280nm
    -génère une courbe d’étalonnage à partir d’une dilution
  2. Par méthode Bradford
    -Basée sur le fait que l’absorbance max d’une solution de bleu de Coomassie passe de 465 nm à 595 nm lorsqu’en présence de protéines (intéractions hydrophobes et ioniques)
47
Q

Qu’est-ce que la technique de détection des protéines Western blot?

A

L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) à une dimension en conditions dénaturantes (avec SDS) qui permet la séparation des protéines sur la base de leurs poids moléculaires.

48
Q

Quelles sont les 2 techniques les plus utilisées en biologie cellulaire?

A
  1. Électrophorèse sur gel d’agarose
  2. Western blot
49
Q

Quel est l’avantage de l’électrophorèse sur gel d’agarose et du Wertern blot?

A

Les protéines peuvent être transférées sur une membrane de nitrocellulose (NC) ou de PVDF pour être mise en contact avec des anticorps spécifiques.

50
Q

Quelles sont les étapes du western blot?

A
  1. Séparation des protéines sur le gel polyacrylamide
  2. SDS dénature les lien non-covalents entre les acides aminés
  3. Acides nucléiques deviennent chargés négativement
  4. le bête-mercaptoéthanol dénature les ponts disulfides
  5. Séparation les protéines en fonction de leur taille sur le gel acrylamide (petite protéine en bas près de la borne positive, grosse protéine en haut près de la borne négatif)
  6. Transfert des protéines sur la membrane (migre vers l’électrode positive)
  7. Détection de la protéine sur la membrane
51
Q

Quel est le principe général de la détection de la protéine sur la membrane de la technique Wertern blot?

A
  1. Blogueur comble les sites non occupés par une protéine
  2. Anticorps monoclonal spécifique se lie la protéine transférée d’intérêt
  3. Anticorps secondaire - HRP se lie à l’anticorps monoclonal
  4. Oxydation
  5. Luminescence
    -Bloqueurs (lait en poudre) comblent les sites non-occupés par les protéines afin d’empêcher les anticorps de se lié non-spécifiquement
52
Q

Quelles méthodes sont utilisées pour détecter les protéines par le western blot?

A
  1. Détection de la chemiluninescence (caméra CCD)
  2. Détection infrarouge (LI-COR Odyssey)

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