Protéine Recombinante II - Hormone Recombinante

Question 1

Qu’est-ce que l’hormone de croissance?

Answer 1

Protéine de 191 a.a. produite par l’hypophyse qui régule la croassance et le développement.

Question 2

Comment est l’activité des hormones de croissance purifiées à partir d’animaux?

Answer 2

Inefficaces chez les humains.

Question 3

Quelles sont les 2 procédés qui permettent de produire l’hormone de croissance humaine dans les bactéries?

Answer 3

1. Forme non-sécrétée
2. Forme sécrétée

Question 4

Qu’est-ce que la forme sécrétée qui permet de produire l’hormone de croissance humaine dans les bactéries?

Answer 4

1. RT (ARN -> ADNc)
2. Coupe l’ADNc (EcoRI et HindIII) pour ne pas avoir les codons codant pour les acides aminés 1 à 24
3. Isole le fragment codant pour les acides aminés 24-191 (gel d’agarose)
4. Ligature des fragments d’a.a. 1à 24 avec celui de 24 à 191 a.a.
5. Coupure par HindIII
6. Ligature dans le vecteur d’expression
7. transformation d’E. Coli
8. L’hormone de croissance s’accumule à l’intérieur de la bactérie
9. L’hormone de croissance est isolée à partir des extraits bactériens

Question 5

Quels sont les rôles des interférons? Quelle est leur source?

Answer 5

Ce sont des cytokines provenant des leukocytes avec des effets paracrines et autocrines modulant les réponses immunitaires innées et adaptatives.

Question 6

Quels sont les effets des interférons sur les cellules cibles?

Answer 6

• Antiviraux directs (réponse innée)
• Antiviraux indirects, diminution synthèse protéique; apoptose (réponse innée)
• Maturation cellules dendritiques (réponse adaptative)

Question 7

Quelles serait l’utilité de l’ARN de leucocytes?

Answer 7

Pourrait servir à isoler et et amplifier les type I interférons (a/b) par RT ou avec des banques d’ADNc.

Question 8

Qu’est-ce qu’une banque d’ADNc?

Answer 8

Une collection de clones (copies) d’ADNc représentant toutes les molécules d’ARNm présentes dans une préparation particulière obtenue à partir de cellules ou d’un tissu biologique donné. Elle représente donc le transcriptome de ce tissu.

Question 9

Comment on prépare les banque d’ADNc?

Answer 9

1. Ajout d’oligo-dt cellulose dans la solution
2. Les ARNm vont se coller à l’oligo-dt grâce à leur queue poly-A qui vont se lier à la séquence TTTTT des oligo-dt
3. Élution et séparation des molécules
4. Reverse transcriptase (formation d’ADNc)
5. Synthèse du second brin d’ADNc (bi-caténaire)

Question 10

Quelles sont les étapes pour produire des IFN recombinants?

Answer 10

• Banque d’ADNc dérivée de leucocytes
• Design d’amorces visant à amplifier l’IFNbeta (exemple)
• PCR
• Sous-clonage de l’amplicon (produit de PCR) dans un vecteur d’expression pour les procaryotes, maxi-prep et séquençage
• Sélection d’une colonie sur pétri agar
• Repiquage de la colonie et culture en milieu liquide (phase de production)
• Extraction et purification

Question 11

Comment on produit un vaccin pour l’hépatite B?

Answer 11

1. Isole la séquence codant pour l’HBsAg (encode pour protéine S)
2. Ligature de séquence HBsAg et vecteur d’expression dans la levure ayant:
   -promoteur de levure
   -terminateur de transcription de levure
   -origine de réplication de levure
   -origine de réplication bactérienne
   -enzyme LEU2 (produit leucine)
   -résistance à l’ampicilline
3. Sélectionne les cellules qui contiennes le plasmide
   dans un milieu sans leucine
4. Croissance dans un fermenteur
5. Centrifugation (isoler les cellules)
6. Casser les cellules
7. Purification des particules HBsAg