Technique de biologie moléculaire 5 Flashcards
Qu’est-ce qu’on peut retenir de l’évolution du séquençage?
Les technologies se spécialisent et sont de plus en plus performantes et les coûts de séquençage sont moindres.
Qu’est-ce que la méthode de séquençage Maxam et Gibert?
- Méthode basée sur la dégradation chimique de l’ADN différentielle pour chacune des 4 bases (A, T, C, G)
- Constitue des coupures spécifiques
- Capable de remonter à la séquence des nuclétides de l’ADN correspondant, en reconstituant les coupures
Quelles sont les étapes du séquençage Maxam et Gibert?
- Isolement du fragment d’ADN à séquencer et séparation de brins
- Marquage: extrémités des deux brins d’ADN à séquencer sont marquées par un traceur radioactif (P32)
- Modifications chimiques spécifiques
- Electrophorèse sur gel acrylamide
- Autoradiographie
- Analyse
Quelles sont les différentes modifications chimiques spécifiques avec la méthode Maxam et Gibert?
- Dimethyl sulfate (DMS) + pipéridine -> Coupure en 5’ des Guanines
- DMS + acide formique + pipéridine -> Coupure en 5’ des Guanine + Adénine
- Hydrazine + 1,5M NaCl + pipéridine -> Coupure en 5’ des Cytosines
- Hydrazine + pipéridine -> coupure en 5’ des Cytosines + Thymines
Quelles sont les étapes de la méthode se séquençage Sanger?
- Amplifie avec ddNTP ou dNTP
- ddNTP: H remplace OH en 3’
- Incorporation aléatoire de terminaisons de chaîne les ddNTP pendant la synthèse d’ADN au lieu des dNTP habituels.
- Cela empêchera la polymérisation de l’ADN suivant le ddNTP ajouté
- Tous les fragments d’ADN marqués par les ddNTP sont ensuite triés par taille (par gel ou capillaires), de sorte que la séquence de nucléotide sera déterminée par le dernier nucléotide incorporé
- Séquence représenté sous forme de chromatogramme selon l’orientation 5’ -> 3’
Comment lire une autoradiographie d’une séquence Sanger migrée sur gel d’acrylamide?
- Part de base (5’) en haut (3’)
- Si la colonne est marqué par:
-ddTTP = A
-ddGTP = C
-ddCTP = G
-ddATP = T
Quels sont les avantages et inconvénients du séquençage Sanger?
Avantages:
-Bonne approche pour vérification des courtes séquences et en mutagénèse
-Très faible coût pour lecture d’une courte séquence
-Bonne précision
-Ne nécessite pas d’appareils trop coûteux
-Demeure très utilisé pour de petites séquences et la validation du Next Gen
Inconvénients:
-Connaissance requise d’une parite de la séquence pour obtenir les amorces
-Difficulté à séquencer de longues séquences répétées (homopolymères)
-Longueur limité de lecture (250-400pb)
-Devient coûteux pour séquencer de longues séquences (nécessite plusieurs réactions)
-Manipulation d’acrylamide et radioactivité si analysé sur gel
-Requiert beucoup de temps pour une séquence de quelques centaines de pb
Qu’est-ce que la méthode de Pyroséqueçage (450)?
- ADN amplifié sur la bille à l’intérieur d’une goutte d’eau entourée par un solution d’huile
- Chaque molécule est piégée dans les alvéoles de ces supports lipidiques
- Suivant la PCR par émulsion, chauqe bille est recouvertes de plusieurs copies d’ADN amplifiés.
- Charge les billes dans un appareil permettant la détection de la séquence (liaison ADN avec un autre type de billes couplées à la luciférase et à la sulfurylase)
- Rajoute une polymrase et des dNTP
- Réaction sulfurylase-luciférase se produit lorsque la polymérase ajoute un nucléotide
- Émission de lumière
Quelles sont les enzymes présentes lors du pyroséquençage et que font-elles?
- Polymérase: ajoute des dNTPs complémentaire au brin
- Sulfurylase: transforme le phosphate PPi en ATP
- Luciférase: transforme l’ATP en lumière
- Apyrase: dégrade les nucléotides en surplus
Qu’elles sont lese 4 grandes étapes de la technique de séquençage illumina (solexa)?
- Préparation de l’échantillon
- Préparation du «cluster»
- Séquençage (par synthèse, fluorescnece)
- Analyse des données
En quoi consiste la préparation de l’échantillon dans le séquençage illumina?
- Décomposer l’ADN en fragments
- Des adapteurs sont attachées aux fragments via PCR
- Alternativement: la «tagmentation» combine la fragmentation et la ligature en 1 étape grâce aux transposases
- Amplification des fragments liés à l’adapteur par PCR et purification sur gel
En quoi consiste la préparation du «cluster» dans le séquençage illumina?
- Hybridation: fragments sont capturés sur une matrice d’oligos
- Polymérisation et formation de ponts moléculaires. ADN complémentaire se lie aux amorces à la surface de Flow cell et l’ADN qui ne se fixe pas en emporté
- Ajout de bases nucléotidiques non marquées et de de l’ADN polymérase pour polymériser et joindre les brins d’ADN attachés à la cellule d’analyse. Cela crée de «ponts» d’ADN double brin
- Linéarisation et dénaturation: ADN double brin est décomposé en ADN simple brin avec la cahleur -> amas denses de séquences ADN identiques
- Modèles prets pour le séquençage
En quoi consiste le séquençage dans le séquençage illumina?
- Ajouts d’amorces et terminateurs marqués par fluorescence au Flow cell
- L’amorce se fixe à l’ADN séquencé
- L’ADN polymérase se lie à l’amorce et ajoute le premier terminateur marqué par fluorescence au nouveau brin d’ADN
-aucune base ne peut être ajouté jusqu’à ce que la base de terminaison soit coupée de l’ADN - Chacune des bases de terminaison (A, C, T, G) émet une couleur différente
En quoi consiste l’analyse des données dans le séquençage illumina?
- Les lectures de séqence nouvellement identifiées sont alignées sur un génome de référence afin de déterminer des homologies de séquences et des mutations.
- De nombreuses variantes d’analyse sont possibles
Quelles sont les étapes du RNA-Seq nécessaire pour tous types de séquençage?
Préparation de la librairie d’ARN:
1. Extraction de l’ARN total:
-ARN ribosomal retiré par «ribo-depletion»
-Enrichissement de l’ARN à queue poly(A) par billes magnétiques poly(T)
2. ARN est fragmenté par sonication (facultatif)
3. Il y a synthèse d’ADNc et réparation finale
4. Ligation de l’adapteur et de l’index
Séquençage:
5. La bibliothèque d’ADNc est amplifiée par PCR et quantifée
6. La bibliothèque est séquencée par méthode approprié (illumina, nanopore, etc.)
7. Les lectures «reads» sont allignées à une séquence référence du génome afin de localiser les transcrits
8. Diverses analyses existent pour identifier les profils d’expression:
-Expression différentielle
-Analyse de fonction - réseaux
-Détection de nouveeaux transcrits, épissage alternatifs
