ADN Recombinant I

Question 1

Qu’est-ce qu’un vecteur? Quels sont les types de vecteurs possibles?

Answer 1

Un vecteur est un ‘’véhicule’’ qui servira à l’entreposage d’un matériel génétique d’intérêt. Il peut également servir à introduire du matériel génétique dans une cellule ou un organisme, et à permettre son expression.
- Plasmides, cosmides, virus, chromosomes artificiels

Question 2

Quels sont les qualités recherchés dans un vecteur?

Answer 2

1) Il peut contenir l’ADN d’intérêt. Il contient par exemple des séquences qui facilitent l’incorporation d’une séquence d’ADN. Voir site de clonage multiple et enzymes de restriction.
2) Il peut se multiplier de manière autonome, ce qui permet d’amplifier l’ADN cloné. Par exemple, il possède une origine
de réplication procaryote.
3) Il permet la sélection de clones d’ADN. Par exemple, il possède 1 ou plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques (= marqueurs génétiques).
4) Il peut présenter différentes composantes selon les fonctions requises. Par exemple, si on désire exprimer le produit d’un gène, le vecteur contiendra un promoteur

Question 3

Qu’est-ce qu’un plasmide de première génération?

Answer 3

Des plasmides qui se retrouvent dans la nature (dans les bactéries). En vue d’y insérer la séquence d’ADN d’intérêt, ils ne possédaient pas un grand nombre de sites de restrictions, ne possédaient pas nécessairement un gène de résistance ni un promoteur facilitant l’expression du gène inséré. Exemples : plasmide F (fertilité), R (résistance), Col (colicines).

Question 4

Qu’est-ce qu’un plasmide artificiel de 2e génération et 3e génération?

Answer 4

• Les plasmides de 2e génération sont issus de plusieurs plasmides naturels, à partir desquels on a récupéré des éléments (origines de réplication, résistance) pour produire des plasmides recombinants utiles et faciles d’utilisation. Nous allons étudier à cet effet pBR322.
• Les plasmides de 3e génération ont été optimisés pour faciliter le clonage et la sélection. L’ajout d’un polylinker (site de clonage multiple) et du gène de la galactosidase sera étudié à partir du vecteur pUC19.

Question 5

À quoi servent les vecteurs d’expression procaryote et eucaryote?

Answer 5

• Procaryote: permettent l’expression de protéines dans des bactéries
• Eucaryote: permettent l’expression de protéines dans des cellules de mammifère

Question 6

Quels sont les autres utilisation des vecteurs autres que pour l’expression de gènes?

Answer 6

Ils servent à emmagasiner de grandes quantités d’ADN, quantité trop grande pour de petits plasmides, ou encore en vue de créer des librairies (pour le séquençage de génomes, par exemple).
- les cosmides, les fosmides, et les chromosomes artificiels (YAC, BAC, HAC).

Question 7

Qu’est-ce qu’un plasmide et que compose un plasmide?

Answer 7

• Un plasmide est une molécule d’ADNdb circulaire qui mène une existence indépendante dans une bactérie.
• Composé de:
  -Un ou plusieurs gènes qui ont souvent une caractéristique utile dans l’hôte (survie en conditions hostiles)
  -Une séquence qui permet sa réplication (origines de réplication)
  -Gènes de résistance

Question 8

Quels sont les types de plasmides d’occurence naturelle et leurs caractéristiques?

Answer 8

1. Fertilité (F): contient les gènes tra qui permettent le transfert de plasmides par conjugaison (pilli sexuels)
2. Résisitance (R): contient un gène qui promeut la résistance à un agent antibactérien (chloramphenicol, ampicilline, mercure)
3. Col: contient un gène encodant pour les colicines, des protéines toxines (bactériocines) qui tuent les bactéries par différents mécanismes (compétition entre bactérie)
4. Dégradation: contient des gènes permettant le métabolisme de substances comme le toluène et l’acide salicylique (source d’énergie alternative)
5. Virulence: confère une pathogénicité (aide l’infection de l’hôte et à fuir la réponse immunitaire)

Question 9

Qu’est-ce que le plasmide pBR322? De quoi il est composé?

Answer 9

Un plasmide artificiel qui est l’un des premiers vecteurs à être utilisé composé de:
- 2 gènes de résistance pour les antibiotiques ampicilline (ampr) et tétracycline (tetr)
- Promoteurs qui précèdent les gènes
- Séquence de Shine-Dalgarno en amont de l’AUG initiateur (liaison d’un ribosome)
- Sites de restrictions
- Origine de réplication

Question 10

Est-il possible de cloner un fragment d’ADN ou un gène dans l’un des sites de restriction présent dans les gènes de résistance aux antibiotiques?

Answer 10

OUI, étant donné l’emplacement de certains sites de restriction, la présence d’un insert pourrait modifier et annuler l’expression d’un gène de résistance.

Question 11

Qu’est-ce que le plasmide pUC19? De quoi il est composé?

Answer 11

• Un vecteur plus pratique que le pBR322.
• Il contient des éléments qui entraînent un mode de clonage et de sélection différent :
  -site de clonage multiple (MCS)
  -Gène de la bêta-galactosidase et possibilité de contrôle de son expression.

Question 12

Quelles sont les caractéristiques des plasmides d’expression modernes?

Answer 12

1. Site de clonage multiple (MCS, Polylinker) qui fait preuve «d’usabilité»
   
   • plusieurs site de restriction pour faciliter le clonage
2. Présence d’un tag (séquence en nucléotide qui sera transcrite en même temps que le gène d’intérêt pour produire une protéine chimérique)
   
   • Utile pour la détection ou l’isolation de la protéines
3. Présence d’un promoteur (promoteur IE du cytomégalovirus humain, CMV)
   
   • contient de nombreux sites à des facteurs de transcription et entraine une puissante expression du gène (le plus utilisé -> promoteur T7 sinon opéron lac)
4. 1 ou plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques
   
   • sélection dans des bactéries ou dans des cellules de mamifères (cassettes de résistance)
5. Différentes origines de réplication (Ori)
   
   • permettent réplication des plasmides dans l’hôte voulu
   • Ori dans E. coli: f1 permet la réplication rolling-circle et l’encapsidation dans un phage; pBR322: origine de réplication dérivée de pMB1.

Question 13

Quelles sont les différentes fonctionnalités des plasmides?

Answer 13

1. Vecteurs de clonage:
   
   • entrepose des fragments d’ADN
   • MSC dans un site de sélection et permet d’identifier les clones positifs
2. Vecteur d’expression
   
   • Pour exprimer un gène
   • Séquence promotrice (P), et parfois expression d’un régulateur de l’expression (R).
   • Terminaison (Ter) de la transcription
3. Vecteur rapporteur
   
   • Pour suivre l’induction d’un gène qui possède une activité enzymatique ou est fluorescent
   • MCS dans la séquence promotrice (P)
   • Terminaison (Ter) de la transcription

Question 14

Qu’est-ce qu’un bactériophage et de quoi est-il composé?

Answer 14

Virus qui infecte les bactéries composé de:

1. Information génétiques pour les composantes des virions
2. Enzymes (lysines -> digèrent peptidoglycane bactérien lors du cylce lytique)
3. Terminase (reconnait COS et fait l’empaquetage du génome viral dans la capside)
4. Séquence COS (permet la cyclisation du génome et l’intégration du génome dans la capside de néo-virion)

Question 15

Quels sont les cycles infectieux des bactériophages?

Answer 15

1. Cycle lytique: réplication et lyse de l’hôte
   -phage mutant
2. Cycle lysogénique: Intégration du génome de l’hôte
   -phage λ

Question 16

Qu’est-ce qu’un plasmide chimérique?

Answer 16

• Plasmides hybrides qui contiennent des séquences provenant de bactériophages.
• Peuvent contenir de plus grands fragments que les plasmides (45 kB)
• Contrairement aux plasmides, ils peuvent être encapsulés dans des phages.

Question 17

Quels sont les plasmides chimériques? Quels sont leurs caractéristiques?

Answer 17

1. Cosmide (plasmide + site COS du phage λ)
   -instable, ‘’high copy’’, se multiplient beaucoup dans la bactérie et donc sont sujets à recombinaisons (éléments répétés)
2. Fosmide (plasmide + Ori de facteur-F + site COS)
   
   • très stable, ‘’low copy’’ (1/cellule).
   • l’origine du facteur F (réplicon) dépend du cycle cellulaire des bactéries, ne se réplique pas de manière indépendante comme un plasmide. Ainsi, ils permettent la génération de librairies stables de génomes.

Question 18

Quels sont les caractéristiques des chromosomes artificiels (AC)?

Answer 18

• Ils permettent l’insertion de très grands fragments d’ADN
• Cependant, leur structure complexe les rend difficiles à manipuler
• Il est difficile de libérer leur contenu dans des cellules cibles

Question 19

Nommez les nucléases et quels sont leurs fonctions?

Answer 19

1. Désoxyribonucléase
   
   • enlève 1 nucléotide à la fois à partir d’une extrémité d’une molécule d’acide nucléique.
   • enlèvent des nucléotide d’un brin seulement ou des 2 brins.
2. Ribonucléase
   
   • coupent des liens phosphodiesters à l’intérieur d’une molécule d’acide nucléique.
   • coupent les liens d’un seul brin ou des 2 brins.
   • non-spécifique (DNAse 1) ou spécifiques (enzymes de restriction).

Question 20

Quelle est la cible spécifique des enzymes de restriction?

Answer 20

Les enzymes de restriction coupent uniquement l’ADN non-méthylé.

Question 21

Combien de type d’enzymes de restriction y a-t-il et quel type est le plus utile?

Answer 21

4 types: I, II, III, IV
- Le type II est le plus utile

Question 22

Que forment les
sites de coupure des enzymes de restrictions?

Answer 22

Coupure formant des palindromes:
- Miroir
- Inversé

Question 23

Quel est le «signal» qui permet la coupure par les enzymes de restriction?

Answer 23

Lorsque les enzymes de restriction reconnaissent une séquence d’ADN, ils coupent le duplex d’ADN sur les 2 brins à l’aide de 2 activités catalytiques.

Question 24

Nommez une façon de couper le duplex d’ADN par les enzyme de restriction et ses produits. Qu’est-ce que ça forme?

Answer 24

L’hydrolyse entraîne la rupture d’un lien phosphodiester, ce qui entraîne l’apparition d’un groupe hydroxyle en 3’ et d’un groupe phosphate en 5’.
- Extrémités cohésives avec overhang en 5’
- Extrémités franches
- Extrémités cohésives avec overhang en 3’

Question 25

Qu’est-ce que des isoschizomères et des néoschizomères?

Answer 25

• Isoschizomères: des enzymes qui ont un même site de restriction
• Néoschizomères: des enzymes qui ont un même site de restriction, mais qui forment des produits différents

Question 26

Quelles sont les conditions nécessaires pour effectuer une digestion d’ADN à l’aide d’enzyme de restriction? Qu’est-ce qui peut affecter négativemment cette expérience?

Answer 26

1. Les endonucléases de type II requièrent la présence de Mg2+ pour fonctionner.
2. Les enzymes fonctionnent de manière optimale selon la concentration en NaCl, Mg2+, le pH (7.4), la température (37oC) et les conditions d’oxydoréduction (ajout d’une petite quantité de dithiothréitol, DTT, pour préserver l’activité).
   - De mauvaises conditions expérimentales peuvent même modifier la spécificité des enzymes = activité star
   - La digestion peut être arrêtée à haute température, à l’aide d’agents chélateurs du Mg2+
   (EDTA), ou suivant une extraction phénol-chloroforme pour enlever l’enzyme.

Question 27

Quelles sont les formes que peuvent prendre les plasmides?

Answer 27

1. Superenroulée
   -migre le plus rapidement sur gel d’agarose
2. Nicked (digestion simple brin)
   -migre moins vite sur gel d’agarose
3. Linéaire (digestion duble-brin)
   -migrera entre les 2

Question 28

Quelle est la fonction des ligases?

Answer 28

• Servent à joindre ensemble différents fragments d’ADN, il faut utiliser une enzyme à activité ADN ligase, effectuer une ligation
• L’activité ligase est nécessaire pour reformer les liens diester, autrement il restera des nick simple-brins

Question 29

Qu’est-ce que la ligase à ADN T4?

Answer 29

• La ligase la plus utilisée en laboratoire.
• A besoin d’ATP pour fonctionner (pas NAD+, comme d’autres)
• Peut effectuer la ligation d’extrémités franches et cohésives
• N’effectue pas la ligation des acides nucléiques sb

Provient de E. Coli infectées par un bactériophage T4

Question 30

Quels sont les 2 ingrédients essentiels de l’ADN recombinant?

Answer 30

Enzymes de restriction et ligase

Question 31

Quelles sont les activités de l’ADN polymérase I?

Answer 31

• Activité polymérase 5’ -> 3’: extensionne le brin d’ADN en ajoutant les bases correspondantes
• Activité exonucléase 3’->5’: activité ’’proofreading’’ permet de corriger des erreurs. On parle de fidélité.

Question 32

Quelle est la version plus utile de l’ADN polymérase I (exonucléase) de E. Coli?

Answer 32

Le fragment Klenow: perdu son activité 5’->3’ exonucléase
-Enlève l’overhang 3’ (exonucléase)
-Rempli l’overhang 5’ (polymérase)

Question 33

Quelles sont les caractéristiques de la transcriptase inverse?

Answer 33

• Polymérase à ADN qui est ARN-dépendante
• Pas d’activité proofreading (par contre développé des RT qui font beaucoup moins d’erreur)
• Essentielles à l’étude de l’expression des gènes par la technique de la polymérisation en chaîne (RT-PCR)
• Permet la formation d’ADN complémentaire

Question 34

Est-il toujours possible de cloner un fragment d’ADN dans un plasmide? Si non, quelle serait la solution?

Answer 34

Non, parfois il faut utiliser des enzymes additionnelles qui sont utilisées à l’occasion en clonge:
- Alkaline Phosphatase (enlève un groupement phosphate)
- T4 Polynucléotide kinase (Transfert un phosphate de l’ATP au 5’-OH)

Question 35

Quelle est l’organisme le plus utilisé pour la technologie de l’ADN recombinant?

Answer 35

E. Coli car elle a de multiples utilités: elle permet la multiplication de plasmides, la sélection de clones, la production de protéines recombinantes…

Question 36

Quels sont les avantages de E. Coli par rapport à la technologie d’ADN recombinant?

Answer 36

• Temps de division cellulaire très court, d’environ 20 minutes
• Conditions de culture simples
• Culture non-dispendieuse
• Possibilité de production de masse (plasmides ou protéines)

Question 37

Quels sont les inconvénients de E. Coli par rapport à la technologie d’ADN recombinant?

Answer 37

• Ne sont pas naturellement compétentes à la transformation
• Aucune modification post-traductionnelle des protéines produites
• Difficulté à établir des ponts disulfures
• Certaines protéines produites sont insolubles et s’accumulent dans des corps d’inclusion
• Certaines effectuent de la recombinaison, ce qui peut modifier les plasmides

Question 38

Quelles sont les 2 techniques pour rendre les bactéries plus compétente?

Answer 38

1. Technique du CaCl2 et choc thermique
2. Électroporation

Question 39

Qu’est-ce que la technique du CaCl2 et choc thermique pour rendre les bactérie plus compétente?

Answer 39

1. Mettre les cellules en présence de CaCl2 sur glace pour augmenter l’association de l’ADN à la
   bactérie
2. Choc thermique qui augmente la perméabilité des membranes
3. Formation de pores qui facilite l’entré d’un plasmide (cellules dépolarisées et membranes perdent des lipides)
4. Plasmide attirés par la membrane rendue positive

Question 40

Qu’est-ce que la technique d’électroporation pour rendre les bactérie plus compétente?

Answer 40

1. Les bactéries sont placées dans des cuvettes spéciales qui peuvent transmettre un courant électrique lorsque placées dans un électroporateur.
2. Les bactéries subissent de manière transitoire des modifications de potentiel membranaire, ce qui augmente leur perméabilité.

Question 41

Quelles sont les conditions optimales pour générer la croissance bactérienne?

Answer 41

• Température de 37 degré
• Temps de dédoublement pour E. Coli: 20 minutes
• Milieu de culture lysogénique riche en:
  -Peptone (riche en protéines)
  -Extraits de levures (vitamines et oligo-éléments et minéraux)
  -NaCl
  -Glucose

Question 41

Quelles sont les étapes de la technique du réplicat?

Answer 41

1. Choc thermique (transformation)
2. Les bactéries sont laissées à 37 degré sans antibiotique pendant 1h dans du LB liquide, pour laisser le temps au plasmide de devenir double-brin et/ou de subir une ligation.
3. Les bactéries sont alors étalées sur LB-agar contenant un antibiotique, et laissées à 37 degré toute la nuit.
4. Les bactéries résistantes vont former des colonies visibles à l’œil nu.
5. Nous ne pouvons pas différencier avec le pBR322 les vecteurs vides des vecteurs recombinants sans utiliser 2 pétris différents (voir image à droite, technique du réplicat).

Question 42

Quelles sont les manipulations à effectuer pour évaluer une croissance bactérienne?

Answer 42

1. Les bactéries fraichement transformées sont habituellement placées 1h à 37 degré à 250-300 rpm dans 1 mL de milieu nutritif (LB) liquide SANS antibiotique.
2. On sélectionne les colonies sur LB-agar avec antibiotiques.
3. Ensuite, elles sont placée dans 250ml-1L de milieu nutritif pendant 16-24h (selon la souche) pour obtenir une densité maximale de bactéries (ex: phase V) en présence d’antibiotique.

Question 43

Qu’est-ce que la méthode de sélection par le criblage bleu-blanc?

Answer 43

Méthode qui entraîne la formation de colonies blanches et de colonies bleues:
- substrat vire bleu si le plasmide contient la bêta-galactosidase
- colonies sont blanches lorsqu’un gène est cloné dans le gène de la bêta-galactosidase -> n’est plus exprimé (colonies blanches ont les plasmides recombinants d’intérêt)
-plasmide de série pUC principalement utilisé

Question 44

Qu’est-ce que la bêta-galactosidase?

Answer 44

La bêta-gal est une enzyme qui libère le galactose. Elle est présente chez de nombreux organismes dont l’être humain (lysosomes, métabolisme des gangliosides) et E. coli (dégradent le lactose dans nos intestins).
- Cette enzyme peut également cliver des substrats artificiels présentant une liaison bêta (1→4).

Question 45

Qu’est-ce que X-gal?

Answer 45

C’est un des substrats de la bêta-galactosidase.
- S’il est donné à des bactéries qui expriment la bêta-gal, un produit coloré bleu sera produit par catalyse enzymatique.

Question 46

Qu’est-ce qu’un opéron?

Answer 46

Un opéron est un ensemble de gènes tous induits ensemble chez les procaryotes.

Question 47

Qu’est-ce que des ARN monocistroniques et polycistroniques?

Answer 47

• Monocistronique: ARN des eucaryotes qui encodent que pour une seule protéine.
• polycistroniques: ARN des procaryotes qui sont traduits en même temps et ont souvent des rôles conjoints dans une voie métabolique quelconque.

Question 48

Que se passe-t-il avec l’opéron lac en absence de lactose?

Answer 48

1. Lacl encode pouir un répresseur de l’opéron
2. Le répresseur va se lier sur l’opérateur
3. Très peu de bêta-gal est induit (des traces)
4. Pas de production d’allolactose (si pas de lactose) pour bloquer le répresseur
5. L’ARNP (ARN polymérase de E. Coli) ne peut pas transcrire

Question 49

Que se passe-t-il avec l’opéron lac en présence de lactose?

Answer 49

1. Le lactose va être transformer par bêta-gal en allolactose
2. L’allolactose va bloquer le répresseur par allostérie
3. L’ARNP se lie au promoteur et effectue la transcription
4. Induction massive de l’opéron
5. Beaucoup de bêta-gal

Question 50

Nommez un analogue artificiel de l’allolactose qui est utilisé expérimentalement?

Answer 50

L’IPTG
- L’IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) est un modulateur allostérique négatif du répresseur de l’opéron lac, LacI, qui lie l’opérateur en amont des gènes. Il a le même rôle que l’allolactose, mais est cependant synthétique et non-hydrolysable.

Question 51

Quels est le principe de dépistage (screening) bleu-blanc?

Answer 51

1. Ligation de l’ADN d’intérêt digéré (insert) avec le vecteur digéré correspondant.
2. Si l’insert placé dans le MCS, il n’y aura plus de bêta-gal induite, parce que le MCS est situé à l’intérieur de la séquence codante de bêta-gal. Cela va changer le cadre de lecture de cette dernière.
3. Si l’insert n’est pas présent, le vecteur se referme sur lui-même (self-ligation), surtout si on n’a pas fait une bonne stratégie de clonage.
4. L’IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) est un modulateur allostérique négatif du répresseur de l’opéron lac, LacI, qui lie l’opérateur en amont des gènes. Il a le même rôle que l’allolactose, mais est cependant synthétique et non-hydrolysable.
5. Si le répresseur est inhibé, bêta-gal est produite uniquement dans les vecteurs où l’insert n’est pas présent. Elle convertira le X-gal en composé bleu. Les clones à sélectionner sont blancs.

Question 52

Quel est l’endroit où s’intègre le génome virale dans le génome bactérien?

Answer 52

Au locus att (séquences de > 240 nt,Natt bactériennes et virales, qui font une recombinaison).