ADN Recombinant II

Question 1

Qu’est-ce qu’un vecteur parental et un vecteur de destination?

Answer 1

-Parental: un vecteur de clonage utilisé dans un sous-clonage vers un vecteur de destination.
-Destination: un vecteur qui présente les différentes caractéristiques essentielles à l’application voulue.

Question 2

Nommez 3 clonage différents qui utilise des plasmides.

Answer 2

1. Clonage en vue de produire un ARN in vitro
2. Clonage en vue de produire une protéine recombinante dans des bactéries (plasmide d’expression procaryotes)
3. Clonage en vue de produire une protéine recombinante dans des cellules humaines (plasmide d’expression eucaryotes)

Question 3

Quelles sont les différentes sources d’ADN à cloner?

Answer 3

• ARN → ADNc
• Fragment d’ADN génomique soniqué ou digéré
• 2 ADNsb de synthèse, hybridés en ARNdb
• D’un autre plasmide (sous-clonage)

Question 4

Quel est l’apperçu général du clonage moléculaire?

Answer 4

1. L’ADN ainsi que le plasmide doivent être digérés par des enzymes de restrictions en vue de créer la molécule d’ADN recombinant (plasmide contenant l’ADN)
2. La sélection est essentielle pour se débarrasser des bactéries non-transformées. Seules les bactéries transformées et exprimant le gène de résistance pourront survivre et poursuivre leur croissance.
3. En se multipliant, les bactéries permettront également l’amplification des plasmides.

Question 5

Est-ce qu’on peut cloner un gène dans un plasmide?

Answer 5

Non c’est trop long/trop gros
- le plasmide a une taille d’insert limitée
- introns ne sont pas pris en charge dans les bactéries et peuvent être sujet d’épissage alternatif dans les cellules de mammifère

Question 6

D’où peut provenir le fragment d’ADN que l’on désire cloner? Quels sont les techniques possibles afin de rendre le matériel génétique compatible pour le clonage?

Answer 6

1. ADN génomique
   
   • PCR ou Fragmentation
2. Plasmide avec insert
   
   • PCR ou digestion avec enzyme de restriction
3. Duplex d’ADN synthétique
   
   • Déjà optimal ou phosphorylation en 5’ avec polynucléotide kinase
4. ARN
   
   • Transcriptase réverse ou PCR

Question 7

Quelles sont les considérations à prendre concernant les extrémités franches?

Answer 7

• Les extrémités franches peuvent être liés par ligation
• Par contre l’efficacité de ligation est très faible et le sens de ligation peut être mauvais
• Risque que le plasmide subisse une ligation sur lui-même sans qu’il ait lié l’ADN d’intérêt

Question 8

Quelles sont des meilleures techniques que des extrémités franches pour cloner un plasmide?

Answer 8

1. Digérer avec les mêmes enzymes de restriction le plasmide et l’ADN d’intérêt. On effectue ensuite la ligation. S’il n’y a pas de site de restriction sur l’ADN d’intérêt, on peut en ajouter par PCR
2. Utiliser la phosphatase alcaline, qui va enlever tous les 5’-PO4 du vecteur, l’empêchant d’être refermé sur lui-même sous l’action de la ligase.

Question 9

Lorsque le plasmide recombinant est formé il reste des nicks (bris simple-brin, manque un phosphate en 5’) et qui s’en charge?

Answer 9

Suite à la transformation bactérienne, les ligases de E. coli se chargeront sans problème de lier ces nicks.

Question 10

Comment on s’assure d’avoir des sites de restriction sur l’insert?

Answer 10

1. Il faut d’abord vérifier les sites de coupure d’enzymes de restriction présents dans le vecteur.
   -Cependant, il y a pratiquement aucune chance que ces sites de restrictions soient présents de part et d’autre de notre ADN d’intérêt à cloner, surtout s’il n’est pas déjà présent dans un plasmide!
2. Il faut ensuite vérifier laquelle des enzymes ne coupe pas à l’intérieur de notre séquence à amplifier.
3. Ensuite, il faut créer des amorces de PCR qui vont contenir des extrémités non-appariées contenant un site de restriction.
   -Il suffira de faire une réaction de PCR et de digérer le produit obtenu.

Question 11

Comment on s’assure que l’insert soit placé dans la bonne direction?

Answer 11

La meilleure technique pour placer l’insert dans la bonne direction est d’utiliser 2 enzymes de restriction distinctes, en incluant au moins 1 enzyme qui génère une extrémité cohésive.
-produit de PCR amplifié avec amorces contenant des sites de restriction
-site de clonage multiple (MCS) du vecteur plasmidique

Question 12

Qu’est-ce que la transcription in vitro (TIV) pour effectuer un clonage pour l’expression d’ARN in vitro?

Answer 12

Il s’agit d’effectuer dans un tube la transcription d’un ARN à partir de l’ADN contenu dans un plasmide.

Question 13

Quelles sont les étapes pour effectuer un clonage pour l’expression d’ARN in vitro?

Answer 13

1- Choix de la séquence d’intérêt (ex: l’ADNc d’un gène)
2- Clonage de la séquence d’intérêt dans un plasmide permettant la TIV
3- Le plasmide est linéarisé et la transcription est effectuée par des ARN polymérases de phage (T7, T3, SP6) en présence de ribonucléotides phosphate (rNTPs)
4- L’ARN peut être modifié de manière co-transcriptionnelle (ajout d’un cap et d’une queue polyA)
5- Purification de l’ARN
6- Formulation (pour tests dans des cellules, in vivo, ou pour des fins thérapeutiques)

Question 14

Quel est l’objectif du clonage pour l’expression d’ARN in vitro?

Answer 14

Produire l’ARN messager de la lipase lysosomale acide (LAL) afin de générer une thérapie par ARN pour soigner les déficiences en LAL, des maladies rares avec manifestations pathologiques sévères.

Question 15

Comment on choisit la séquence d’intérêt pour effectuer un clonage pour l’expression d’ARN in vitro?

Answer 15

• On obtient la séquence de LAL (gène LIPA) dans une base de données comme Pubmed Gene

Question 16

Comment on effectue le clonage de la séquence d’intérêt dans un plasmide permettant la TIV pour l’expression d’ARN in vitro?

Answer 16

1. Déterminer la stratégie de clonage
   -plasmide pBluescript II: site de clonage multiple dans gène beta-galactosidase -> criblage bleu-blanc
2. Utilisation de logiciel (NEBcutter) pour identifier les sites de restrictions dans la séquence LAL
3. Déterminer les enzymes de restrictions qui peuvent couper dans le site de clonage multiple sans couper dans la séquence d’ADN d’intérêt (HindIII et NotI)

Question 17

Comment se fait le design d’amorce antisens?

Answer 17

Il faut déterminer le complément inverse de la séquence:
1. Écrire au long la séquence 3’UTR de LAL, SENS 5’->3’
2. Ajouter la séquence de coupure de l’enzyme NotI et quelques nucléotides additionnels
3. Déterminer le complément inverse

Question 18

Quel est l’ensemble des expériences à réaliser avant de pouvoir utiliser le plasmide recombinant pour effectuer la transcription in vitro (TIV)?

Answer 18

1. Préparer l’insert LAL
   -Isoler l’ARNm de LAL à partir des cellules humaines
   -RT-qPCR avec ajouts de sites de restriction HindIII et Not1
   -Digestion et purification sur gel d’agarose
   -Dosage
2. Préparation du vecteur pBluescript II
   -Achat, amplification dans E coli
   -Digestion HindIII et Not1
   -Digestion et purification sur gel d’agarose
   -Dosage
3. Ligation avec T4 ADN ligase
   -Transformation E coli
   -Sélection ampicilline et sélection bleu-blanc
   -Amplification, purification, dosage, validation par digestion et séquençage
   -Expérience d’ITV

Question 19

Qu’est-ce qu’il y a de différent quand on veut cloner pour l’expression de protéines recombinantes dans des bactéries?

Answer 19

On ne désire pas seulement produire un ARNm, mais bien une protéine, qu’elle soit normale ou mutante. Ceci implique un système permettant la traduction des ARNm.

Question 20

Qu’est-ce qui est très important dans le clonage pour l’expression de protéines recombinantes dans des bactéries?

Answer 20

1. Importance du cadre de lecture: Lorsque nous désirons produire une protéine, il est d’une importance capitale de respecter le cadre de lecture du ribosome, autrement nous produirons une protéine ayant une mauvaise séquence.
2. Importance du AUG: Codon initiateur de la traduction, encodant pour une méthionine (Met)
3. Importance de la séquence de recrutement de ribosomes (RBS): La séquence Shine-Dalgarno

Question 21

Quels sont les éléments importants du vecteur pour effectuer un clonage pour l’expression de protéines recombinantes dans des bactéries?

Answer 21

1. Système inductible à l’IPTG
   -IPTG permet de produire une protéine avec tag GST (glutathion Stransférase) placé en N-terminal
2. Fi Ori, une origine de réplication d’un phage qui permet une réplication simple-brin spéciale
   -permet l’encapsidation du génome simple brin dans des phages.
3. TEV: Tobacco Etch virus : site de clivage
4. LacI : encode pour le répresseur lac

Question 22

Qu’est-ce que le tag GST?

Answer 22

Une enzyme importante dans la détoxification de substances variées nocives (souvent de nature radicalaire).
- Elle utilise comme co-substrat le glutathion, un tripeptide au rôle antioxydant, qu’elle conjugue sur les substrats.
- Ce tag permet la purification de protéines marquées, selon une procédure nommée GST pulldown

Question 23

Qu’est-ce que le GST pulldown du tag GST?

Answer 23

Grâce aux Tag GST, il est possible d’isoler une protéine sans avoir à utiliser un anticorps spécifique pour cette protéine (immunoprécipitation). La production d’anticorps est relativement longue et dispendieuse.
-Des billes sont couplées au glutathion de manière covalente.
-Pour l’élution, on ajoute du glutathion ou on utilise une enzyme qui clive le tag.

Question 24

Quel est l’ensemble des expériences à réaliser avant de pouvoir utiliser le plasmide recombinant pour effectuer la production de protéine dans E coli et GST pulldown?

Answer 24

1. Préparer l’insert LAL
   -Isoler l’ARNm de LAL à partir des cellules humaines
   -RT-qPCR avec ajouts de sites de restriction (à déterminer)
   -Digestion et purification sur gel d’agarose
   -Dosage
2. Préparation du vecteur pEX-N-GST
   -Achat, amplification dans E coli
   -Digestion
   -Digestion et purification sur gel d’agarose
   -Dosage
3. Ligation avec T4 ADN ligase
   -Transformation E coli
   -Sélection ampicilline
   -Amplification, purification, dosage, validation par digestion et séquençage
   -Induction IPTG
   -Extraction, GST pulldown

Question 25

Quels sont les éléments importants du vecteur pour effectuer un clonage pour l’expression de protéines recombinantes dans des cellules de mammifère?

Answer 25

1. Neor : cassette de résistance à la néomycine, pour permettre l’expression stable (sera revu en thérapie génique)
2. Ampr: pour la sélection lors de l’amplification dans des bactéries
3. SV40 ori : pour la multiplication dans certaines cellules (exprimant l’antigène large T, comme les COS7).
4. Kozak: site d’initiation de la traduction, important chez les eucaryotes
5. HA: Tag hemagglutinine. Où sera placé de tag sur la protéine?

Question 26

Quelles sont les étapes de la procédure pour effectuer un clonage pour l’expression de protéines recombinantes dans des cellules de mammifère?

Answer 26

1. Extraction d’ARN des cellules humaines
2. RT de l’ARN total
3. PCR de l’ADNc
4. Digestion du produit amplifié
5. Ligation du produit digéré avec le vecteur linéarisé
6. Transformation du vecteur recombinant avec insert
7. Sélection et amplification des bactéries avec vecteur(s)
8. Extraction des plasmides des bactéries amplifiées avec le bon vecteur
9. Purification
10. Vérification et séquençage
11. Transfert des cellules de mammifère (ex: transfection)

Question 27

Comment on peut isoler des protéines spécifiques?

Answer 27

1. Produit des plasmides avec l’ADNc d’une protéine comme insert dans des bactéries (forme des protéine sans tag)
2. Immunoprécipitation d’une protéine sans tag avec un anticorps spécifique à cette protéine
3. Couplage de cet anticorps à des billes
   -les billes contiennent des molécules liées de manière covalente qui ont une grande affinité pour
   les fragments Fc des anticorps
4. Centrifugation et lavages nous permettent de collecter des billes couplées à la protéine et se
   débarrasser de tout le reste

Question 28

Quel tag est utilisé pour purifier les protéines?

Answer 28

Le tag His
- protéine de fusion contient en N-terminal un tag poly-Histidines (His) qui entre en coordination avec les atomes de nickel (image) liés fortement aux billes

Question 29

Comment on arrive à purifier les protéine avec le tag His?

Answer 29

Pour l’élution, on ajoute de l’imidazole (structure). Ce dernier va entrer en compétition pour la
liaison du nickel, libérant ainsi la protéine.

Question 30

Comment sont les tag dans l’ADNc?

Answer 30

• L’ADNc cloné peut ne pas présenter de Tags, ou présenter un Tag qui n’est pas utile.
• Les Tag peuvent être placés en C ou en N-terminal.
• Les Tags vont donc déterminer les applications du cDNA encodé par un vecteur.

Question 31

Comment varie la fluorescence?

Answer 31

Selon la quantité de protéine produite, le signal luminescent ou fluorescent va varier, habituellement de manière directement proportionnelle.
- Protéine fluorescente (GFP)
- Protéine à activité enzymatique qui convertit un substrat en produit fluorescent

Question 32

Qu’est-ce qu’un plasmide rapporteur?

Answer 32

• Un plasmide dont l’activité enzymatique, ou la quantité de la protéine avec activité enzymatique, dépendra d’un autre paramètre: par exemple l’activité d’un promoteur, ou la stabilité d’une extrémité 3´UTR.
• Le système rapporteur ‘’rapporte’’ donc un autre type d’activité, il permet de mesurer cette autre activité indirectement. C’est cette dernière qui nous intéresse en réalité.

Question 33

Qu’est-ce qui est utilisé lors de l’essai classique «dual luciferase»?

Answer 33

• L’utilisation de 2 luciférases:
  -Photinus pyralis (luciole)
  -Renille reniformis (cnidaire)
• L’utilisation de 2 vecteurs luciférase:
  1: -vecteur permettant la production de luc2 (luciole)
  -promoteur doit être cloné dans le site de clonage multiple
  2: -vecteur permettant la production de Rluc (Renilla)
  -promoteur plutôt faible ce qui permet une expression constitutive peu influencée par des facteurs externes

Question 34

Quel est le but de l’essai classique «dual luciferase»?

Answer 34

Ce système à 2 vecteurs a pour objectif d’inclure un vecteur de normalisation
- En effet, les conditions expérimentales ou traitements pourraient effectivement induire des variations d’expression du gène d’intérêt (ex: Firefly luciférase) mais cet effet pourrait être non-spécifique car issu d’un mécanisme non désiré ou prévu.
- Il convient donc de normaliser le signal obtenu avec ce vecteur sur celui généré par un vecteur additionnel. Ce vecteur est choisi pour des propriétés précises, et il encode une luciférase différente.